鲤IGF2b基因5''侧翼区序列克隆及不同鲤该区域GC富集区的甲基化分析

鲤(Cyprinus carpio)胰岛素样生长因子2b(insulin-like growth factor 2b,IGF2b)基因为鲤IGF基因家族重要的成员,已有的研究表明5'侧翼区序列对其功能的发挥有重要作用。因此,采用基因组步移法获取5'侧翼区序列,通过亚硫酸盐修饰的方法分析不同品种该区域GC富集区的甲基化状况。本文成功从鲤基因组DNA中获得695 bp的IGF2b 5'侧翼区序列。已获取的IGF2b 5'侧翼区序列经过TFSEARCH分析后发现了多个转录因子结合位点和TATA框,通过BLAST比对发现,鲤IGF2b 5'侧翼区DNA序列与斑马鱼(Danio rerio)IGF2b基因相比,相似性为87%。检测该区域富含GC的序列17个位点,发现建鲤(C.c.var.jian)有2个个体的3个位点出现甲基化,而黄河鲤(C.c.haematopterus)只有1个个体1个位点出现甲基化,这说明2个品种鲤在这个区域出现甲基化修饰的几率低,也验证了这2品种在该基因该区域GC富集区是稳定的。     

3×3完全双列杂交F1不同阶段生长特点的分析

为了了解鲤杂交F1不同组合、不同阶段生长性状的变化情况,研究以建鲤、黄河鲤和黑龙江野鲤3个鲤品种双列杂交F1为试验材料,通过组合、组合内性别间、性别、不同时期体重、体增重以及协方差分量的分析,来确定完全双列杂交F1生长性状的变化特点,以及在此过程中起重要作用的影响因素。结果表明:不同时期各个组合体重不同,不同时期组合内性别间体重差异不同;不同时期不同性别间体重差异不同;不同协方差分量,同一组合PIT标记17个月时的体重的最小二乘估计值不同,同一个协方差分量,9个组合中极值估计值出现的组合也不同;除PIT标记17个月后的体厚作为协方差分量外,性别之间体重没有差异,其余分量均是雌鱼体重显著高于雄鱼体重。这些说明选取合适的协方差分量对组合的选择和育种的结果有重要影响。     

我国新引进吉富品系尼罗罗非鱼群体的遗传多样性分析

选取罗非鱼(Oreochromis spp.)第二代遗传连锁图谱中的26个微卫星位点,对淡水渔业研究中心引进的、由60个家系组成的吉富品系尼罗罗非鱼(O.niloticus)群体进行遗传结构分析。结果显示,26个微卫星位点在吉富罗非鱼群体中共检测到124个等位基因,各位点的等位基因数为3～7个,平均4.8个。片段长度104～322 bp,平均杂合度观测值为0.622 1,平均杂合度期望值为0.642 3,平均多态信息含量(PIC)为0.633 4。所检测的26个位点中,有25个位点属于高度多态位点(PIC0.5),占所检测位点的96.15%;1个位点属于中度多态位点。结果表明,该吉富罗非鱼群体多态信息含量丰富,遗传多样性水平较高。因而该群体仍然具有较大的选育潜力,可以作为选育的基础群体开展进一步的选育工作。     

鳙基于10个微卫星标记的亲子鉴定分析

为开展鳙(Hypophthalmichthys nobilis)家系选育工作,本研究进行了基于微卫星标记的亲子鉴定研究。试验中筛选了10个扩增效率较高的微卫星标记,通过引物荧光修饰,引物结合毛细管电泳分型技术,对鳙48尾亲本及384尾子代进行了基因分型,并计算了等位基因频率和模拟分析和亲子鉴定等分析。结果发现,各位点的等位基因数介于4~13之间,其中9个位点均具有较高的多态性和杂合度(PIC>0.5,He>0.5),研究发现位点的多态性信息含量(PIC)与亲本对排除率(E-PP)存在显著正相关(p<0.01)。模拟分析结果显示,该10个标记预计可用于已知性别的50组亲本(100尾)或未知性别的50尾亲本的鉴定分析(鉴别成功率>95%)。亲子鉴定发现,对试验中2个交配组(每组12对亲本)的鉴别成功率分别为98.96%和100%;且父母本对子代的贡献率存在极显著差异(p<0.01)。通过累积位点的鉴定分析发现,当标记数为7个和9个时分别能满足试验中12组和24组亲本对应子代的鉴定分析(鉴别率>95%),模拟分析和亲子鉴定分析成功率趋势基本符合。本研究所开发的亲子鉴定技术可为鳙家系选育提供技术支持。     

富集优势基因型的后备亲本筛选以及相关分子标记的遗传效应分析

选取黄河鲤新品系亲本和子代共450尾,5对微卫星引物和4个基因区段扩增引物开展基因型检测,并检测它们与体重的关联性以及分析相应的遗传效应。结果显示:Koi42和4个SNPs位点对体重有显著的影响,获得具有超过富集2个优势基因型的候选亲本共13尾,富集优势分子标记基因型的候选亲本生长性能优势明显。通过多元逐步回归分析,利用AIC最佳模型筛选到COⅠ626、D-Loop253和Koi42共3个位点,发现Koi42贡献率较大,经Fisher精确性检验,发现其与性别存在关联,其加性效应接近显著水平（P < 0.05）。检测的多个上位效应组分中,仅有D-Loop253和Koi42的加性效应间的互作达到显著水平。对遗传方差组分进行剖分发现,加性方差占11.4%,两个位点的加性效应构成的上位效应占到77.5%,因此这3个分子标记对体重的影响主要以上位效应为主,而且是两两加性效应的占比较大,可以推断出D-Loop 253和Koi42两个分子标记的上位效应起主要作用。综上所述结果提示Koi42及与其有互作的D-Loop253可用于黄河鲤新品系的标记辅助选择,可以开展多个分子标记的富集选择。     

鲤TRAP分子标记反应体系的建立与优化

针对鲤(Cyprinus carpio)这一主要水产养殖品种设计了靶位区域扩增多态性(target region amplified polymorphism,TRAP)分子标记的反应体系,对影响TRAP反应体系的各参数,包括Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA和引物浓度进行了优化,建立了适合鲤的、稳定、可重复的TRAP-PCR反应体系。在15μlPCR反应体系中,Mg2+浓度为1.5mmol/L、dNTPs浓度为0.35mmol/L、两个随机引物浓度均为3pmol/L、固定引物浓度为10pmol/L、含DNA模板60ng、TaqDNA聚合酶1.0U。鲤的TRAP反应程序为:94℃4min,1个循环;94℃45s,35℃45s,72℃1min,5个循环;94℃45s,53℃45s,72℃1min,35个循环;72℃10min,1个循环。这一优化体系的建立为今后进行鲤群体遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面的研究提供了新的分子标记。