下一代测序技术在高龄女性的胚胎植入前非整倍体遗传学检测中的应用

本研究以微阵列比较基因组杂交(array comparative genomic hybridization, aCGH)平台为参照,旨在探究基于下一代测序(next-generation sequencing, NGS)的胚胎植入前遗传学非整倍体检测(preimplantation genetic testing for aneuploidies, PGT-A)对高龄不育患者辅助生殖临床结局的影响.本文回顾性分析了上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院2016年6月至2019年3月行PGT-A的104对夫妇的临床资料,共纳入125个移植周期,其中正常胚胎移植周期为107个,嵌合体胚胎移植周期为18个.主要结果指标包括正常囊胚检出率和嵌合体囊胚检出率,以及临床妊娠率、流产率和活产率.研究结果表明,与a CGH平台相比, NGS的嵌合胚胎的检出率显著提高,且部分嵌合体胚胎移植获得了健康胎儿.对于移植检测结果为正常的胚胎,基于NGS的PGT-A和基于aCGH的PGT-A对高龄女性辅助生殖的临床妊娠率、流产率和活产率的影响无显著差异.     

无创产前DNA检测可有效筛查唐氏综合症降低出生缺陷

为了探究无创产前DNA检测筛查唐氏综合症降低出生缺陷的效果,本研究选择2012年4月至2017年12月我院收治的孕期产检6 192例孕妇作为研究对象,应用DNA测序方法对孕妇血浆中胎儿游离DNA进行染色体非整倍体检测,并检测其灵敏度和特异性,同时采用羊水核型分析两种结果。研究显示,阳性共73例,69例做了进一步检查,显示40例胎儿染色体检查核型正常继续妊娠,29例染色体异常。比较不同年龄组的孕妇血清学筛查唐氏综合征高风险情况,研究表明随着孕妇年龄的增加,DS阳性率逐渐降低(p0.05);血清学筛查后胎儿游离DNA (cffDNA)检测与染色体核型分析的阳性例数基本一致(p0.05)。本研究表明,采用产前无创检测胎儿游离DNA操作方便,检测灵敏度和特异性高,不会对胎儿的正常发育造成不良影响,且阳性检测率与羊水核染色体核型结果基本相同,是无创产前诊断唐氏综合征的重要方法,值得在临床上推广使用。     

单染色体靶向富集方法的建立

靶向富集技术具有良好的均一性、特异性和灵敏性,只需较低的测序覆盖度即可满足后续的分析。该技术被广泛应用于特定位点重测序和染色体构象等研究。为了靶向富集测序文库中特定的染色体DNA片段,本研究以21号染色体为例,采用人胚肝二倍体细胞CCC-HEL-1建立了一种单染色体靶向富集方法。具体步骤如下：（1）首先将人正常核型二倍体细胞同步化到G2/M 期,制备染色体悬液;然后流式分选出21号单染色体。（2）采用多重退火环形扩增技术（MALBAC）对21号染色体DNA进行扩增;用扩增的DNA产物构建文库。（3）利用体外转录合成、生物素标记的RNA探针与文库进行液相杂交,捕获并验证捕获效率。荧光定量PCR检测结果证明,特定的21号染色体呈上百倍的富集,而靶标文库则富集了近60 倍。结果提示,特异单染色体靶向富集方法成功建立。该法不仅可实现任一单染色体的靶向富集,用于单条染色体功能组学研究,而且还可能用于查找特定疾病相关的染色体异常（如DNA突变、异位、重复及倒置等）,具有一定的实用意义。     

无创胚胎染色体筛查技术在单囊胚冻胚复苏移植中的应用价值及其活产结局的因素分析

摘要 目的：探讨无创胚胎染色体筛查技术（NICS）在单囊胚冻胚复苏移植中的应用价值,分析影响活产结局的因素。方法：回顾性分析2019年1月至2021年12月我院收治的197例行单囊胚冻胚复苏移植患者的临床资料,53例行NICS检查且检测结果提示囊胚染色体拷贝数正常（NICS组）,26例NICS检测结果异常予以排除,118例未接受NICS检测（非NICS组）。收集临床资料并追踪妊娠结局,根据妊娠结局将患者分为活产组（75例）和非活产组（96例）,采用单因素及多因素Logistic回归分析影响单囊胚冻胚复苏移植活产的因素。结果：NICS组活产率高于非NICS组（P＜0.05）。单因素分析显示活产组女方年龄小于非活产组（P＜0.05）,基础卵泡雌激素（FSH）水平、常规试管婴儿（IVF）周期≥2个低于非活产组（P＜0.05）,优质胚胎数、移植日子宫内膜厚度和NICS检查比例、发育成囊胚时间为D5比例高于非活产组（P＜0.05）。多因素logistic回归分析显示女方年龄偏大、发育成囊胚时间为D6是影响单囊胚冻胚复苏移植活产的危险因素（P＜0.05）,NICS检查是其保护因素（P＜0.05）。结论：NICS筛查胎儿染色体异常可提高单囊胚冻胚复苏移植活产率,产妇高龄和囊胚发育速度过慢是影响活产的主要危险因素。在单囊胚冻胚复苏移植前有必要进行NICS检查,并尽量选择D5囊胚以提高活产率。     

下一代测序技术在表观遗传学研究中的重要应用及进展

下一代测序技术(Next generation sequencing,NGS)的出现,极大地促进了表观遗传学的研究。将NGS技术引入表观遗传学,便形成了以NGS为基础的各种表观遗传学测序及研究方法,如:全基因组亚硫酸氢盐测序法(Whole genome bisulfite sequencing,WGBS)、简化代表性亚硫酸氢盐测序法(Reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)、甲基化DNA免疫共沉淀测序(Methylated DNA immunoprecipitationsequencing,MeDIP-seq)、染色质免疫共沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation-sequencing,ChIP-seq)、Tet辅助重亚硫酸盐测序法(Tet-assisted bisulfite sequencing,TAB-seq)、各种染色体构象捕获测序(Chromosome conformation capture sequencing,3C-seq)技术、DnaseⅠ-seq/MNase-seq/FAIRE-seq以及RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)。这些方法的应用和普及改变了人们对多种表观遗传现象的传统认识,使研究人员能够更加全面地深入了解各种表观遗传标志在机体内的广泛分布,以及如何在外界因素的影响下发生相应的动态变化。文章概述了当今主要商业NGS平台的原理和特点,系统介绍了以NGS方法为基础衍生出来的各种表观遗传学测序及研究方法,并在此基础上对近年来应用NGS技术在表观遗传学研究领域中取得的最新研究成果进行了综述。     

线粒体基因组测序策略和方法

本文综述了线粒体基因组测序策略和方法,在传统测序方法中介绍了基于物理分离线粒体DNA的克隆文库测序方法和基于PCR扩增产物的直接测序方法,后者重点介绍了基于长PCR扩增产物的引物步移法和基于总DNA的引物步移法;应用新一代高通量测序方法有基于总DNA样品的方法,包括需要预扩增mtDNA的多物种平行高通量和无需预扩增mtDNA的高通量方法,基于总RNA样品的转录组测序方法等。在实际工作中,选择哪种方法取决于研究规模、样品大小和保存状态、经费情况等。总的来说,基于长PCR扩增产物的引物步移法尤其适合小规模昆虫线粒体基因组研究,而对于大规模线粒体基因组研究来说,NGS技术无疑是省时省力的最佳选择。     

电脉冲介导金鱼囊胚细胞融合及其发育能力的研究

本实验首次成功地利用电脉冲介异法使金鱼的囊胚细胞融合,融合率高于95％,并通过细胞核移植方法,将融合细胞的细胞核移入金鱼成熟未受精的去核卵内,以了解融合后细胞核的发育能力。实验中共移植111个细胞核,得44个囊胚、7个原肠胚和1条活了8天的幼鱼(因不进食而死亡)。并对移核后发育至囊胚的胚胎用静态光度计测定了DNA含量,共测定了11个移核胚胎的细胞,其中9个移核囊胚细胞核的DNA含量增加,这一结果证明:利用电脉冲介导法能有效地转移外源染色体,供体核有促进个体发育的能力。为人工干与鱼类染色体组的组成,进一步研究鱼类个体发育对染色体倍性的依赖关系以及体细胞遗传提供了一条新途径。     

胰岛素对小鼠胚胎印迹基因Igf2/H19甲基化水平和表达的影响

探讨胰岛素对小鼠早期胚胎体外发育影响的分子机理.将小鼠2细胞胚胎培养于KSOM+0.25 μg/ml胰岛素培养基内,发育至桑椹胚和囊胚.提取桑椹胚和囊胚的总RNA和DNA.实时定量PCR分析,实验组桑椹胚Igf2 mRNA表达是对照组的4.7倍,H19表达是对照组的5.7倍;实验组囊胚Igf2 mRNA表达是对照组的1.8倍,而H19表达量是对照组的2.3倍;BSP测序法分析Igf2/H19印迹控制区的甲基化水平,实验组桑椹胚、囊胚的甲基化率分别为7.3%和32.3%,分别比对照组下降86.4%和35.4%.结果显示,胰岛素降低植入前胚胎Igf2/H19印迹控制区DNA甲基化的水平,从而使Igf2和H19基因表达升高.     

BGC823和A549细胞染色体着丝粒点变异

癌细胞的一个显著细胞遗传学特征是染色体非整倍性畸变,但其畸变的机制至今仍然不清。因此,本文从与染色体分离直接相关的着丝粒点变异的角度,采用Cd-NOR同步银染技术对BGC823细胞和A549细胞染色体Cd变异进行了分析,以探索癌细胞非整倍性畸变的发生机制。结果表明：（1）BGC823细胞染色体Cd缺失率为1.75%、迟滞复制率为0.28%、小Cd率为1.82%、Cd-NOR融合率为0.95%,与正常人胚胎绒毛细胞染色体Cd相比较,BGC823细胞染色体Cd缺失和Cd-NOR融合显著升高（P＜0.0125）,而Cd迟滞复制和小Cd两者没有显著性差异。（2）A549细胞染色体Cd缺失率为2.73%、迟滞复制率为0.94%、小Cd率为1.73%、Cd-NOR融合率为0.71%,与正常人胚胎绒毛细胞染色体Cd相比较,A549细胞染色体Cd缺失和Cd迟滞复制显著升高（P＜0.0125）,而小Cd和Cd-NOR融合两者没有显著性差异。提示BGC823细胞染色体非整倍性畸变可能主要源于Cd缺失和Cd-NOR融合,而A549细胞染色体非整倍性畸变可能主要源于Cd缺失和Cd迟滞复制。     

利用CRISPR/Cas系统对血友病B小鼠进行基因纠正的初步探索

血友病B是人类常见的X染色体遗传的隐性遗传疾病,目前对于遗传疾病的治疗还没有很好的办法,通过基因治疗可以实现对遗传病的彻底治愈。本研究利用高效基因编辑技术CRISPR/Cas系统,对血友病B小鼠尝试基因修复进行初步的探索,将突变的凝血因子IX(Factor IX,FIX)基因进行同源替换,修复为正常序列。本研究中将同一种纯合突变类型的小鼠交配之后得到的受精卵,进行细胞核显微注射。对收集到的8枚囊胚的基因组中的靶位点,进行巢氏PCR扩增,直接进行测序检测基因型序列。检测结果为4枚囊胚的基因被成功编辑,其中3枚囊胚为靶序列的基因敲除突变,而有1枚囊胚成功进行同源重组,实现基因纠正。     

探讨植物单染色体测序中的假阳性问题

单细胞测序技术目前虽已广泛应用于人类、动物、微生物等物种的研究,但由于细胞壁的存在,使得该技术在植物上的应用举步维艰。如果能先分离出植物单条染色体,然后再应用单细胞测序技术进行扩增和测序,则可以避免细胞壁的干扰,从而具有重要的应用价值。虽然科研人员一直尝试针对单条植物染色体进行测序,但目前尚未见有成功的报道,也未见有文章对失败的原因进行讨论。该研究以六倍体中国春小麦为材料,针对使用单细胞测序技术进行单染色体扩增过程中出现的假阳性问题进行了探讨,分析了单染色体扩增失败的主要原因,并通过高通量测序技术研究了外源污染的可能来源。结果表明:在对实验器具、耗材、环境污染严格防控的基础上,人体接触可能是造成污染的主要来源;同时,推测单染色体之所以扩增失败可能是因为染色体自身超螺旋状态造成引物难以结合和复制。该研究还针对存在的问题提出了可行性建议,为将来成功进行单染色体测序提供了有益的借鉴。     

绵羊胚胎性别鉴定试剂盒的研究

根据绵羊Y-染色体的特异序列和常染色序列分别设计了确定公羊Y-染色体特异序列的3对特异性引物和内标基因的4对特异性引物。单重PCR扩增绵羊基因组DNA,筛选出了3对Y-染色体特异引物和3对羊DNA特异内标引物。将不同的绵羊Y-染色体特异引物与内标引物组合,利用多重PCR扩增绵羊基因组DNA,筛选出了1个可用于羊早期胚胎性别鉴定的PCR引物组合:A0/C1。按照最优PCR扩增DNA条件配制了绵羊PCR性别鉴定试剂盒并成功应用于绵羊血液、已知性别的绵羊成纤维细胞和胚胎,表明本研究建立的体系完全可用于绵羊早期的胚胎性别鉴定。     

基于高通量测序技术对染色体外环状DNA研究的最新进展

染色体外环状DNA (extrachromosomal circular DNA, eccDNA)是一种真核生物染色体外的闭合环状DNA结构，长度和染色体起源具有较高异质性。ecc DNA这一名称目前主要指大小在数百kb以内的小分子染色体外环状DNA，包括micro DNA、小多分散环状DNA (small polydispersed circular DNA, spcDNA)以及其他未分类的小分子eccDNA等。高通量测序技术(high-throughput sequencing, HTS)是一种可以同时对百万条DNA分子进行序列测定的技术，又名新一代测序技术(next generation sequencing, NGS)，具有高通量、高灵敏度、高准确度等优势。近年来高通量测序结合生物信息学分析技术不仅在揭示eccDNA染色体起源、分子结构、发生机制和潜在功能以及循环系统中的eccDNA分子特征研究等方面发挥了重要作用，而且推动了eccDNA在甲基化等表观遗传学方面的研究。生物信息学软件的发展和eccDNA分析算法的开发也对其研究提供了重要帮助。血浆以及尿液等液体活检常用体液样本中...     

采用诱导环化酶制备Illumina Mate-paired DNA文库

新一代测序技术(NGS)的文库制备方法在基因组的拼装中起着重要作用。但是NGS技术制备的普通DNA文库片段只有500 bp左右,难以满足复杂基因组的从头(de novo)拼装要求。三代测序技术的读长可以达到20 kb,但是其高错误率及测序成本过高使得其又不易推广。因此二代测序的Mate-paired文库制备技术一直在基因组的de novo拼装中扮演着非常重要的角色。目前主流的NGS平台Illumina制备的Mate-paired文库的片段范围只有2~5 kb,为了得到更长的可用于Illumina平台测序的Mate-paired文库,本研究首次整合并优化了Illumina和Roche/454两种测序平台的Mate-paired文库制备技术,采用诱导环化酶来提高基因组长片段DNA的环化效率,成功建立了20 kb Mate-paired文库制备技术,并已将该技术应用于人类基因组20 kb Mate-paired文库制备。该技术为Illumina平台制备长片段Mate-paired库提供了方法指导。     

不良孕产夫妇着丝粒—动粒复合体的细胞遗传学研究

为研究不良孕产夫妇着丝粒－动粒复合体（centromere kinetochore complex,CKC)变异与不良孕产的相关性,探索不良孕产中非整倍体表成的细胞遗传学基础,应用改良的着丝粒点－核仁组织区（Cd-NOR)同步银染技术,分别对53对不明原因的不良孕产夫妇和57对已生育正常儿的正常夫妇外周血淋巴细胞染色体CKC变异类型及频率进行研究和分析。结果发现,不良孕产夫妇其小Cd,Cd消失、Cd迟滞和Cd-NOR融合频率均较正常对照组明显增高,两相比有显性差异（P＜0．05）。CKC变异频率增高可能是导致不良孕产非整倍体形成的主要原因之一。     

引物原位标记技术快速检测人类染色体非整倍性

染色体数目异常是人类染色体疾病的重要类型, 经常导致胚胎丢失、胎儿流产、婴儿死亡、先天畸形和神经发育异常等出生缺陷。文章应用引物原位标记(Primed in situ labeling, PRINS)技术快速检测人类染色体非整倍性, 率先采用更新的非ddNTP阻断的多色PRINS技术, 对人类外周血淋巴细胞和精子等多种样本进行标记; 然后对不同靶标序列的标记效率及不同荧光色素的发光特点通过实验进行评估, 获得关于PRINS技术的多项反应原理参数, 并筛选标记顺序以获得均一稳定的标记效果, 最后进行临床FISH探针与PRINS的标记比较实验。通过实验比较PRINS技术与传统FISH技术之间的标记特点与差别, 评估PRINS的实际应用效果。在2.5 h内标记了同一精子核内的多条染色体, 单色以上标记达到99％。同时在人类外周血淋巴细胞中也得到较好的标记效果。与FISH技术相比, PRINS的这些优点使得它成为诊断染色体非整倍性变异的首选技术。     

NGS技术在作物基因组研究中的应用

新一代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)在阐明复杂和高度重复的基因组结构,DNA序列与基因组结构变异同重要农艺性状之间的关系等方面具有重要作用。从NGS系统的开发与作物基因组测序,NGS与转录组分析,NGS与全基因组关联图谱,及SNPs开发与预测育种等方面,综述了NGS技术在作物基因组研究中的应用,可为作物基因组研究提供理论基础。     

利用PCR方法从人染色体DNA中扩增G-CSF基因

利用PCR技术从染色体基因组DNA中扩增大DNA片段具有相当大的难度。本试验采用碱变性模板以及热启动等方法,成功地扩增出1.5kb的人基因组DNA,并讨论了影响扩增大DNA片段特异性和产量的因素。     

小鼠早期胚胎性别鉴定的研究

用改进的细胞遗传学方法制备染色体标本,鉴定了小鼠晚期桑椹胚(晚桑)、囊胚和扩展囊胚(扩囊)的性别。在实验中,利用小鼠早期胚胎染色体标本制备的理想实验参数,鉴定了242枚小鼠晚桑、囊胚和扩囊的性别,性别鉴定成功率分别为80.4％、99.0％和94.5％。以细胞遗传学方法鉴定小鼠早期胚胎性别的结果为标准,得出用间接免疫荧光法和PCR(聚合酶链反应)扩增SRY(y染色体的性别决定期)部分序列法分别鉴定100枚和26枚小鼠胚胎性别的准确率相应地为74.0％和92.3％。     

单细胞基因组测序技术新进展及其在生物医学中的应用

随着单细胞基因组测序技术的建立与发展,对细胞基因组特征的分析进入了单细胞水平。单细胞的基因组分辨率不但使研究人员能够在单细胞尺度上分析肿瘤细胞的异质性,也使得传统上难以检测的稀有细胞的基因组研究成为可能。这些稀有细胞往往具有重要的生物学意义或临床价值,如癌症患者血液中循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,CTC)的基因组检测或三代试管婴儿植入前胚胎细胞的遗传缺陷诊断与筛查(preimplantation genetic diagnosis/screening, PGD/PGS)。本文总结了近年来发展的各种单细胞基因组扩增技术及其优缺点,并介绍了单细胞基因组测序技术在肿瘤生物学和临床检测中的应用,以期为单细胞基因组测序技术在临床检测中应用开发提供参考。