单细胞基因组测序技术新进展及其在生物医学中的应用

随着单细胞基因组测序技术的建立与发展,对细胞基因组特征的分析进入了单细胞水平。单细胞的基因组分辨率不但使研究人员能够在单细胞尺度上分析肿瘤细胞的异质性,也使得传统上难以检测的稀有细胞的基因组研究成为可能。这些稀有细胞往往具有重要的生物学意义或临床价值,如癌症患者血液中循环肿瘤细胞(circulatingtumorcell,CTC)的基因组检测或三代试管婴儿植入前胚胎细胞的遗传缺陷诊断与筛查(preimplantation genetic diagnosis/screening, PGD/PGS)。本文总结了近年来发展的各种单细胞基因组扩增技术及其优缺点,并介绍了单细胞基因组测序技术在肿瘤生物学和临床检测中的应用,以期为单细胞基因组测序技术在临床检测中应用开发提供参考。     

基于液体活检与二代测序解析肺腺癌患者靶向药耐药机制

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR TKI)是治疗非小细胞肺癌的一线药物,但在治疗过程中难以避免耐药性的产生.目前已知的获得性耐药机制主要包括EGFR T790M突变、HER2基因扩增、MET基因扩增、转分化等,并尚有15％～20％的患者的耐药机制不明.本研究发展了一种基于液体活检与高通量测序方式解析肺癌患者靶向药物耐药机制的方法.我们通过液体活检的方式取得了接受EGFR TKI治疗肺腺癌患者治疗前及EGFR TKI耐药后的胸腔积液样本,在对其中的肿瘤细胞进行富集后,通过基因组及转录组的高通量测序并结合生物信息学分析,解析耐药前、耐药后基因组变异以及基因表达的差异,进而探究该患者的靶向药物耐药机制,为制订新的治疗方案提供科学依据.     

肺癌恶性胸腔积液中稀有肿瘤细胞的鉴定与单细胞测序分析

肿瘤细胞的异质性是指肿瘤细胞在基因组或表型水平上具有不同特征。在外界环境压力或人为杀伤因素刺激下,肿瘤细胞具有不同的响应方式,从而导致它们在细胞增殖、侵袭转移及耐药能力等方面产生差别,尤其是一部分具有转移能力的肿瘤细胞能脱离原位组织并在远处器官形成转移灶。因此,肿瘤细胞的异质性为其发生转移和耐药提供了可能。传统的肿瘤异质性研究主要基于不同位置原位组织样本中的群体细胞,缺乏单细胞层面的解析,尤其是对具有转移能力的肿瘤细胞的异质性研究。本研究建立了基于肺癌恶性胸腔积液中转移性肿瘤细胞的单细胞研究路线,首先利用代谢标志物鉴定恶性胸腔积液中高代谢活性的肿瘤细胞,其次通过单细胞Sanger测序揭示这些肿瘤细胞具有一致的驱动基因突变特征,然后利用高通量测序技术对肿瘤细胞染色体拷贝数变异进行分析,从而揭示同一患者具有转移能力的肿瘤细胞即使具有相同的驱动基因突变特征,但在基因组层面上仍具有异质性,可进一步细分为若干子群。本研究结果对于更深入地理解肿瘤转移机制具有重要意义。     

肺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的快速分离与体外培养

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)是从肿瘤病灶脱落并进入外周血液循环的处于游离状态的肿瘤细胞,代表了肿瘤病灶的分子特征,可用于对肿瘤的“液体活检”。但外周血中CTCs数目极为稀少,使得后续针对CTCs的分子与功能分析面临巨大挑战。鉴于此,本文建立了一种基于微流控芯片和免疫磁珠的能够快速从肺癌患者的外周血中分离CTCs的方法。该方法直接针对全血进行一步分离,可避免血液样本预处理及富集等过程对细胞造成的损伤,从而有效地保护CTCs的活性(>90%)。分离得到的CTCs可富集在小体积中(80 μL),实现高密度的细胞培养,完成体外扩增,扩增后的CTCs可以被进一步冻存、复苏及再次增殖培养,表明已经对患者血液中的CTCs成功建系。本文进一步对CTCs进行了基因突变(EGFR、KRAS、PIK3CA、TP53和BRAF)检测及荧光标记葡萄糖类似物(2-NBDG)摄取的功能分析,证明CTCs存在较大异质性。本研究成功实现了对外周血中稀少的CTCs进行体外培养,并对CTCs进行了基因、蛋白、功能等各个层面的分析,这对于肿瘤精准医疗具有重要的临床意义。