Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(AcTPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ac×Ds的杂交组合354个.检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性.结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4%.检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中.在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7%.对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制--转座和不完全切离等现象.获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录.探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略.     

Ac／Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(Ac TPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ae×Ds的杂交组合354个。检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性。结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4％。检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中。在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7％。对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制——转座和小完全切离等现象。获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录。探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略。     

插入玉米Ds转座因子的水稻转化群体及其分子分析

转座子标签法是一种利用转座因子插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离转座因子插入的旁邻顺序,进而克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物功能基因组学的研究中是十分有用的。为此目的,将玉米的Ds因子及bar基因连接至载体pCAMBIA1300的T-DNA区域中,构建成重组Ti质粒pDsBar1300。pDsBar1300中T-DNA区域中的潮霉素抗性基因可在转化过程中用作水稻转化植株的选择标记。插入在Ds因子中的bar基因可追踪转化后代的Ds因子。pDsBar1300通过根瘤农杆茵介导引入水稻品种中花11号的幼胚组织。从各转化愈伤组织中获得了1400株独立的Ds水稻转化植株。通过PPT抗性检测和PCR分析证明了水稻转化植株中Ds因子的整合。Southernblot分析了转化植株基因组中Ds因子的插入拷贝数,其中单拷贝插入比率约占70％。这些插有Ds因子的水稻转化植株,当引入自主型的Ac因子反式活化Ds因子后,可使Ds因子跳跃到不同位点上,就可得到更多的突变植株。     

不同启动子控制下Ac转座酶基因的表达对玉米Ds因子在水稻中切离频率的影响

用水稻愈伤组织比较了Ac启动子、35S启动子与Ubi启动子控制下Ac转座酶基因（Ts）的表达对Ds因子切离频率的影响。结果表明Ubi启动子与Ac转座酶编码区嵌合基因（Ubipro-Ts）反式激活Ds因子的切离频率最高,达到了72.9%。通过杂交将Ubipro-Ts基因导入Ds因子转化植株,得到9株Ubipro-Ts基因与Ds因子共存的F1代杂交水稻植株,其中有8株Ds因子发生了切离。用Inverse-PCR的方法从其中一株杂交植株中克隆到Ds因子的旁邻序列,其DNA顺序与亲本中Ds因子原插入位点的序列不同,表明Ds因子转座到了新的基因组位点。     

不同启动子控制下Ac转座酶基因的表达对玉米Ds因子在水稻中切离频率的影响

用水稻愈伤组织比较了Ac启动子、35S启动子与Ubi启动子控制下Ac转座酶基因（Ts）的表达对Ds因子切离频率的影响。结果表明Ubi启动子与Ac转座酶编码区嵌合基因（Ubipro-Ts)反式激活Ds因子的切离频率最高,达到了72．9％。通过杂交将Ubipro-Ts基因导入Ds因子转化植株,得到9株Ubipro-Ts基因与Ds因子共存的F1代杂交水稻植株,其中有8株Ds因子发生了切离。用Inverse-PCR的方法从其中一株杂交植株中克隆到Ds因子的旁邻序列,其DNA顺序与亲本中Ds因子原插入位点的序列不同,表明Ds因子转座到了新的基因组位点。     

转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因整合分析与品系特异性检测

利用染色体步移方法分离获得转cry1C基因抗虫水稻吉生粳3号外源基因旁侧序列及其水稻基因组中的插入位点,并建立了吉生粳3号品系特异性PCR检测方法。通过对吉生粳3号外源基因左、右边界旁侧序列分别与水稻基因组序列和T-DNA序列的比对分析确定其插入位点,发现T-DNA在水稻基因组(日本晴)2号染色体上的基因间区2790685-2790589位点(GenBank登记号:NC_029257.1)。根据T-DNA插入位点,在插入位点两侧基因组区域和T-DNA左边界设计特异性引物,建立了吉生粳3号事件特异性PCR检测方法,为吉生粳3号的身份识别提供了准确、快速的检测技术手段。     

水稻基因组上一个Ds切离及其双位点插入行为的分子鉴定

玉米转座元件Ac/Ds是hAT转座子家族的成员, 导入水稻基因组后具有转座活性, 尽管转座机制还不完全清楚, 但它们通常经保守的非复制型“剪切-粘贴”过程转座。研究表明, 在Ac编码的转座酶作用下, Ds从原位点切离后常优先重新插入到连锁位点。文章利用TAIL-PCR技术从水稻一个Ds插入突变体及其回复突变体中分离Ds侧翼序列, 结合生物信息学分析方法, 对Ds在突变体上插入位点、回复突变体内切离足迹和重新插入位点进行了分子鉴定。结果显示, 突变体中Ds从3号染色体切离后, 在原插入位点残留了8 bp足迹序列(CATCATGA), 引起Ds标记基因外显子和内含子数目增加, 从而影响基因结构。切离后的Ds重新插入回复突变体第2和第6号染色体上, 分别编码烟草胺氨基转移酶和衰老相关蛋白的2个基因的编码区。因此, 典型的“剪切-粘贴”机制不能完全解释Ds的转座行为, Ds转座存在“剪切-复制-粘贴”的特点。     

基于启动子捕获系统的水稻基因的分离

为了分离水稻的基因及其启动子,该实验室构建了T-DNA(GUS)结构的水稻启动子捕获系统,对其中编号为113#、T-DNA单拷贝插入、GUS报告基因为组成型表达的阳性捕获系进行了进一步分析。潮霉素筛选结合GUS组织化学染色获得了T-DNA插入的纯合株(113#-22和113#-26);Inverse法分离得到T-DNA插入位点水稻基因组DNA旁邻序列,测序和BLAST结果表明,T-DNA反方向插在水稻基因组4号染色体预测基因的内含子中;扩增T-DNA插入位点上游2kb左右DNA片段,构建启动子分析质粒转化水稻‘中花11’胚性愈伤组织,获得转基因植株,GUS组织化学染色模式与113#阳性株系一致。结果表明,该预测基因及其启动子是利用启动子捕获系统所捕获到的候选基因。     

T-DNA标签在转基因水稻基因组中的整合特点

利用热不对称交错PCR (TAIL-PCR),对200个含T-DNA插入的转基因水稻株系进行分析,获得了159个T-DNA右边界侧翼序列. 其中,92个序列含有T-DNA右边界和侧邻的水稻基因组序列,78个序列与已公布的水稻BAC/PAC克隆有97%～100%的同源性,从而可作为T-DNA标签定位在水稻的12条染色体上. 结合先前定位的169个T-DNA标签,对T-DNA在水稻基因组中的整合特点进行了分析. 结果发现,在T-DNA右边界和侧邻的水稻基因组序列的连接处,14.6%的T-DNA标签含有3～74bp的填充序列. 在不含填充序列的连接处,21.3%的T-DNA标签,在整合后的T-DNA右边界与侧翼的水稻基因组序列之间显示出3～5 bp的微同源性. 填充序列和微同源性的存在,揭示了T-DNA在水稻基因组中的整合既存在双链断裂修补机制,又存在单链裂缝修补机制. T-DNA倾向于整合到富含A/T核苷酸的基因组区域,即主要在基因的5′和3′端调控区以及内含子中.     

稻瘟菌突变体T-DNA插入位点的精细定位和插入模式的研究

随机挑取已构建的37个稻瘟菌T-DNA突变株,利用TAIL-PCR技术扩增出T-DNA插入位点的侧翼序列,测序并进行比对分析。结果显示:成功获得扩增产物并测序的序列共有39条,T-DNA边界序列为稻瘟菌序列的有19条,其余20条为载体主干序列。在这有效扩增为稻瘟菌序列的19条中,有10条是T-DNA右侧翼序列与稻瘟菌序列,9条为左侧翼序列加稻瘟菌序列。分析T-DNA剪切位点,10条右侧翼序列中有9条的剪切位点相同,这与农杆菌介导T-DNA转化植物一样。而左边界的剪切位点就没有这种规律性。研究也精细确定了17个不同突变株的T-DNA插入位置,为后续的基因功能研究奠定基础。     

插入含Ds因子的T-DNA产生的水稻脆秆突变株的遗传和分子分析

在构建由农杆菌介导的玉米Ds转座因子插入的水稻转化群体中,得到了一个茎秆等组织发生脆性突变的株系。理化指标定量测定表明,脆性株系的载荷强度和纤维素含量都比正常植株低很多,可溶性糖含量略有减少。对这个突变株的分子检测结果表明Ds因子在脆性株系中为单位点插入。检测了自前3代（T1,T2,T3)植株中T-DNA(Ds)插入与脆性表型的共分离关系。初步结果表明这个突变是T－DNA（Ds)的插入造成的,这个突变基因可能与水稻纤维素合成有关。     

水稻第4号染色体不同位置的Ds转座子转座行为的分析

使用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11,构建了在第4号染色体不同位置插入了Ds（dissociation）因子的水稻转化群体和带有Ac（activator）转座酶基因的转化植株。将携带了Ac转座酶基因的植株与不同Ds转化植株杂交,杂交F1代同时带有Ac转座酶和Ds因子（Ac／Ds植株）。用PCR方法检测了杂交F1代Ds的切离频率,结果发现靠近第4号染色体着丝粒附近的Ds转座子切离频率低,而靠近第4号染色体末端区域的Ds转座子切离频率高,这表明Ds转座子的原始插入位置对其杂交后代的切离频率有很大的影响,推测与原始插入位点附近的染色体结构有关。     

水稻剑叶突变体的表型及T-DNA旁邻基因分析

从已构建的水稻（Oryza sativa L.）T-DNA插入突变体中鉴定获得一株穗部额外发育出叶片的突变体,并根据该叶片的形态学位置将其命名为剑叶突变体（J4）。研究表明这种额外发育的叶片呈现明显的缺陷,主要表现为叶片短小、表皮细胞变小、叶片中维管束数目减少等。进一步通过TAIL-PCR和inverse-PCR的方法克隆该突变体中T-DNA插入位置的旁邻序列,从而准确地将T-DNA定位到2号染色体上。基因表达分析显示,T-DNA插入位置附近的AK100376基因在J4突变体以及表型类似突变体neck leaf 1中的表达均被明显下调,可初步将其确定为与剑叶突变体表型相关的候选基因。     

植物转座因子

转座因子 (ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅｅｌｅｍｅｎｔ ,ＴＥｓ)是指在生物细胞中能从同一条染色体的一个位点转移到另一个位点或者从一条染色体转移到另一条染色体上的ＤＮＡ序列。 1 947年美国冷泉港实验室的“玉米夫人”ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ首先在玉米中发现并描述了转座因子。转座因子的发现 ,打破了传统遗传学上关于基因在染色体上固定排列及同源染色体交换的观念 ,揭示了基因的流动性 ,具有重要的意义。1 .转座因子的结构特点和分类到目前报道为止 ,至少在 32种植物上有转座因子存在 ,其中研究最多的是玉米、金鱼草、拟南芥等[1] 。其…     

Ac/Ds(GUS)结构介导的水稻启动子捕获系统的建立

构建了基于Activator/Dissociation(β-glucuronidase)[简称Ac/Ds(GUS)]结构的捕获质粒p13B,用于分离水稻基因启动子.以此质粒用衣杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,对获得的18个独立转化株的T2代植株进行了抗除草剂筛选,从141个抗除草剂转基因植株中用PCR方法检测到其中37株是Ds因子发生了转座的植株,而且这种转座到新位置上的Ds因子是遗传的.初步观察到其中5株的GUS染色呈阳性.     

插入玉米Ds转座因子的水稻转化群体及其分子分析

转座子标签法是一种利用转座因子插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离转座因子插入的旁邻顺序,进而克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物功能基因组学的研究中是十分有用的,为此目的,将玉米的Ｄｓ因子及ｂａｒ基因连接至载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００的Ｔ－ＤＮＡ区域中,构建成重组Ｔｉ质粒ｐＤｓＢａｒ１３００。ｐＤａＢａｒ１３００中Ｔ－ＤＮＡ区域中的潮霉素抗性基因可在转化过程中用作水稻转化植株的选择标     

利用Inverse PCR快速筛选单个T-DNA拷贝转基因水稻植株的方法

为了获得单个T-DNA插入拷贝的植株, 我们建立了一套利用Inverse PCR(IPCR)快速检测转基因水稻中T-DNA拷贝数的方法。用IPCR的方法可以扩增出与已知T-DNA序列相邻的水稻基因组DNA未知序列,由此推测转基因水稻植株中T-DNA的拷贝数。我们共对15个转化株系20棵不同植株的DNA进行了IPCR检测。其中12株表现为T-DNA单拷贝插入,3株为双拷贝插入,1株为三拷贝插入。另外4株未检测到T-DNA插入拷贝。IPCR分析结果经过Southern杂交和测序的验证。     

拟南芥光周期开花突变体的筛选和基因的鉴定

以双子叶模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）突变体crylcry2为实验材料,用舍有激活标记质粒DSK1015的农杆菌浸花进行转化,构建了拟南芥T-DNA插入突变体库．通过筛选和观察分析,获得了一些开花时间比crylcry2明显延迟或明显提早的突变体．采用IPCR（inverse PCR）和TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）等方法,鉴定了这些突变体T-DNA插入位点的基因组旁邻序列,并采用半定量RT-PCR对插入位点两侧基因的mRNA水平进行了分析,初步鉴定了与开花相关的候选基因,为进一步研究其功能,深入研究隐花素调节光周期开花的作用机制奠定了基础．     

水稻Ac×Ds后代基因组DNA中Ds侧翼序列的扩增及其Ds插入分析

采用TAIL-PCR技术从经鉴定含Ac/Ds双元件的材料中扩增Ds侧翼序列并测序, 对水稻Ac×Ds后代基因组DNA进行Ac和Ds插入的PCR分析。利用NCBI的BLAST软件, 以Ds侧翼序列为待查询序列进行GenBank在线搜索比对, 获得Ds插入相关基因的染色体定位和功能注释等信息。对扩增的93个有效Ds侧翼序列进行分析, 结果显示, 有21个水稻杂交后代中Ds插入于基因编码区, 其余72个插入在基因间序列, 其中12个插入在特定基因的上游3 kb以内的间隔区。本研究强调了提高Ds侧翼序列扩增和Ac/Ds植株筛选效率的技术关键。     

转基因水稻BPL9K-2事件特异性检测方法的建立

利用hiTAIL-PCR(high efficient thermal asymmetric interlaced PCR)法扩增获得了转基因水稻BPL9K-2的外源基因插入位点的左旁侧序列450bp,与水稻参考基因组数据比对发现其左边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 765位核苷酸残基之后。根据水稻参考基因组序列和外源基因右边界序列,设计引物扩增得到485bp的特异片段,通过数据库比对发现其右边界插入在水稻基因组第10号染色体短臂的1 037 825位核苷酸残基之前。因为外源基因插入和非正常重组,水稻基因组上缺失了59个核苷酸。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻BPL9K-2的事件特异性定性PCR检测方法,可以分别扩增到片段大小为449bp和485bp的特异条带。该方法特异性好,灵敏度高,能够在BPL9K-2基因组DNA相对含量为0. 1%的模板中检测出转基因成分。依据旁侧序列,建立了快速鉴定转基因后代植株外源基因型的三引物PCR检测方法。这些方法的建立,为转基因水稻BPL9K-2的应用和检测提供了技术支持。