Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(AcTPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ac×Ds的杂交组合354个.检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性.结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4%.检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中.在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7%.对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制--转座和不完全切离等现象.获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录.探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略.     

插入玉米Ds转座因子的水稻转化群体及其分子分析

转座子标签法是一种利用转座因子插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离转座因子插入的旁邻顺序,进而克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物功能基因组学的研究中是十分有用的。为此目的,将玉米的Ds因子及bar基因连接至载体pCAMBIA1300的T-DNA区域中,构建成重组Ti质粒pDsBar1300。pDsBar1300中T-DNA区域中的潮霉素抗性基因可在转化过程中用作水稻转化植株的选择标记。插入在Ds因子中的bar基因可追踪转化后代的Ds因子。pDsBar1300通过根瘤农杆茵介导引入水稻品种中花11号的幼胚组织。从各转化愈伤组织中获得了1400株独立的Ds水稻转化植株。通过PPT抗性检测和PCR分析证明了水稻转化植株中Ds因子的整合。Southernblot分析了转化植株基因组中Ds因子的插入拷贝数,其中单拷贝插入比率约占70％。这些插有Ds因子的水稻转化植株,当引入自主型的Ac因子反式活化Ds因子后,可使Ds因子跳跃到不同位点上,就可得到更多的突变植株。     

不同启动子控制下Ac转座酶基因的表达对玉米Ds因子在水稻中切离频率的影响

用水稻愈伤组织比较了Ac启动子、35S启动子与Ubi启动子控制下Ac转座酶基因（Ts）的表达对Ds因子切离频率的影响。结果表明Ubi启动子与Ac转座酶编码区嵌合基因（Ubipro-Ts）反式激活Ds因子的切离频率最高,达到了72.9%。通过杂交将Ubipro-Ts基因导入Ds因子转化植株,得到9株Ubipro-Ts基因与Ds因子共存的F1代杂交水稻植株,其中有8株Ds因子发生了切离。用Inverse-PCR的方法从其中一株杂交植株中克隆到Ds因子的旁邻序列,其DNA顺序与亲本中Ds因子原插入位点的序列不同,表明Ds因子转座到了新的基因组位点。     

不同启动子控制下Ac转座酶基因的表达对玉米Ds因子在水稻中切离频率的影响

用水稻愈伤组织比较了Ac启动子、35S启动子与Ubi启动子控制下Ac转座酶基因（Ts）的表达对Ds因子切离频率的影响。结果表明Ubi启动子与Ac转座酶编码区嵌合基因（Ubipro-Ts)反式激活Ds因子的切离频率最高,达到了72．9％。通过杂交将Ubipro-Ts基因导入Ds因子转化植株,得到9株Ubipro-Ts基因与Ds因子共存的F1代杂交水稻植株,其中有8株Ds因子发生了切离。用Inverse-PCR的方法从其中一株杂交植株中克隆到Ds因子的旁邻序列,其DNA顺序与亲本中Ds因子原插入位点的序列不同,表明Ds因子转座到了新的基因组位点。     

Ac／Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(Ac TPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ae×Ds的杂交组合354个。检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性。结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4％。检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中。在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7％。对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制——转座和小完全切离等现象。获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录。探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略。     

用无启动子的GUS报告基因捕获水稻基因启动子

构建了嵌合质粒p13DGUTs,它是在Ds转座子中插入了无启动子的B．葡萄糖醛酸酶报告基因(GUS),用于分离水稻基因启动子。将p13DGUTs转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,获得了496个转基因植株。抗性愈伤组织与转基因植株的GUS染色与PCR分析表明整合在水稻染色体上的Ds因子都发生了随机跳跃。转基因植株T0代与部分T1代的GUS染色结果表明,M92转基因植株中Ds转座子整合位置上游的水稻基因启动子指导GUS基因的表达及表达的特性是可遗传的。文章对此方法在分离水稻基因启动子与基因上的应用进行了讨论。     

含Ds转座因子的T-DNA在水稻染色体上的分布研究

应用农杆菌介导的方法获得了有Ds因子插入的3000多株水稻转化群体, 用Inverse PCR方法, 从部分独立转化植株中分离了590条含Ds因子的T-DNA插入位点处的右侧旁邻水稻染色体序列. 根据旁邻序列中T-DNA右边界与侧翼水稻序列之间的插入序列的特征可分成6个主要类别, 其中类型Ⅰ是主要类型, 为通常的T-DNA整合, 即T-DNA右边界序列与水稻染色体序列相连, 或者其间插入小于50 bp的序列片段; 类型Ⅱ为T-DNA右边界旁先接T-DNA载体序列, 再与水稻序列相接的重组类型. 340个类型Ⅰ和Ⅱ的旁邻序列通过与已知的水稻染色体序列数据库一致性比较分析, 确定了它们在水稻染色体上的分布位置, 构建了一个Ds因子在水稻12条染色体插入的框架结构. 这340个有Ds因子插入的位点在整个染色体上平均相距0.8 Mb. 分析在第1条染色体上T-DNA(Ds)插入情况显示有21％的频率插入到预测基因的外显子中. T-DNA(Ds)在染色体上分布位置的确定, 使我们可以选择合适的Ds因子插入株作为起始株系, 导入Ac转座酶基因后, 使Ds发生转座, 从而获得新的Ds插入突变株, 为进一步利用Ds转座标签法分离水稻基因创造了条件.     

转座子Tn5096对刺孢吸水链霉菌北京变种RF220转座的诱变

用大肠杆菌/链霉菌穿梭质粒pCZA168(bla,tsr,Tn5096,ColEI rep,Strep repts)多次转化农抗120产生菌刺孢吸水链霉菌北京变种(S.Streptomyces hygrospinocus var. beijingensis)RF220的原生质体,均未得到转化子。来自吸水链霉菌应城变种(S.Streptomyces hygroscopicus var.)10-22突变株的链霉菌质粒pIJ702(tsr mel+)可以转化RF220,但转化频率只有数十个转化子/μgDNA。用来自RF220本身的pIJ702对消除pIJ702后的RF220的原生质体进行了再转化,转化率没有明显的提高。用氨苄青霉素和甘氨酸协同处理RF220的菌丝体,并经-70℃冷冻原生质体再转化,得到了4个pCZA168的转化子。质粒提取、酶切、抗性测定表明：4个转化子中pCZA168中大肠杆菌DNA部分均被切除,成为大小约50～60kb的小质粒,命名为pWZH102(tsr,Tn5096,strep repts)。用pWZH102上的转座子Tn5096对RF220进行转座实验,在168个转座个体中,有2株可能为抗生素生物合成阻断变株,另有产生抗生素水平各异的变株,说明Tn5096的转座可以引起表型的不同变化。     

T-DNA插入水稻群体中卷叶突变体R1-A2的遗传分析

在根癌农杆菌介导的T-DNA(携带有除草剂Basta抗性基因bar和Ds因子)转化中花11水稻群体中,获得了一个叶片发生明显内卷的突变体R1-A。经过连续三代的分离鉴定,获得突变体的纯合株(R1-A2),并与中花11号进行杂交,在调查的36个F_1植株中,全部表现为卷叶,并对Basta除草剂都表现为抗性。在852个F_2单株中,卷叶为645株,正常叶207株,卷叶和正常叶的比例为3:1,其中,卷叶株均对Basta表现抗性,正常叶株均对Basta表现敏感,表明卷叶性状和Basta抗性存在着共分离关系。用扩增Ds因子的引物,对F_2中45个卷叶抗性株进行PCR鉴定,都获得预期长度的Ds因子片段,进一步表明在这些卷叶的植株中都有T-DNA的插入;而30个正常叶敏感株都不能检测到Ds的特征片段。在以卷叶突变(R1-A2)为回交亲本的F_1B_1植株中,全部植株表现卷叶;在以中花11号为回交亲本的F_1B_1植株中,卷叶和正常叶植株的分离比为1:1。上述结果表明该卷叶突变是个显性突变,受一个基因所控制,且该基因的突变与T-DNA的插入有关。     

基因标记、转化、表达与检测

821276大肠杆菌户葡枪普酸酶甚因作为鉴定酵母菌株的标记〔英〕/petering,J……了Am.J。Enol.Vitie一1991,42(i)一6一11〔译自DBA,1991,10(18),91一10239二 大肠杆菌介葡糖普酸酶(GUS)uidA基因(分离自质粒pKLG4的HindIH片段)经改造,即在其编码序列上连接酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子和终止子序列,构成pAW220新质粒,用于在酵母中的表达。pAW220在转化酿酒酵母3A时,可整合至第13染色体的ILVZ基因中。筛选抗性除草剂甲基化Sulfometuron(10产g/ml)的转化株。用Southern杂交法筛选转化株中在ILVZ基因内含有GUS者(3 AM)。3 AM培养于1…     

激活标签法构建拟南芥突变体库及其表型分析

以拟南芥(ArabMopsis thaliana)野生生态型(Columbia)植株为实验材料,以含有激活标记双元质粒pCB260的农杆菌进行转化,并以抗除草剂Basta为筛选标记,构建了拟南芥激活标签突变体库,所用pCB260双元质粒含有两个Ds位点、一个GFP标记基因与一个抗basta标记基因,可以方便高效地筛选转基因植物.目前经初步筛选获得了约10 000个独立转化株系(T1代),其中约50个株系具有明显的表型变化,包括花期改变、株型变异、叶形特异、育性降低、花发育异常、种子颜色变浅等.运用TAIL-PCR技术,成功获得了其中10个表型特异株系的T-DNA侧翼序列,分别分布于拟南芥基因组的5条染色体上.     

CHI-PAT双价基因遗传转化贵州禾来拢

以贵州禾来拢幼胚为转化受体,用农杆菌介导法将几丁质酶和抗除草剂抗性双价基因(CHI-PAT)导入来拢幼胚,筛选出抗性愈伤组织并获得抗性植株.抗性植株经GUS组织化学及PCR检测呈阳性,转基因植株对50 mg/L的Basta溶液有抗性.初步证明CHI和PAT基因已整合进了水稻基因组中.     

人工合成的植物化猪α乳清蛋白基因在转基因拟兰芥的表达

将一个398bp的植物化的猪α乳清蛋白基因(Lactalbumin,LA)编码区克隆到带有花椰菜花叶病毒的35S启动子的质粒中。对它们进行PCR检测和序列分析,证实这些阳性克隆是实验预期的重组质粒。随即将35S启动子-α-乳清蛋白基因-终止子这一表达单元克隆到双元载体pCG-CB中,用该重组质粒双元载体pCG-CB-Lact转化农杆菌V3101后,以农杆菌法进行拟兰芥植物转化,用除草剂Finale对转化植物进行抗除草剂基因筛选,得到一些抗除草剂的转化植株。对这些抗除草剂植株进行猪α乳清蛋白基因PCR分析,成功筛选到带有猪α乳清蛋白基因并且可以在后代稳定遗传的转基因植物。Western blot蛋白质表达分析,表明猪α乳清蛋白在拟兰芥中成功表达,并且猪仅乳清蛋白被正确加工成天然蛋白。     

水稻OsBP-73基因表达需要其内含子参与

该实验室以前的研究表明,水稻OsBP-73基因含有2个外显子和1个长度为2 471 bp的内含子.该文报告用OsBP-73基因ATG翻译起始密码子(在第1外显子中)上游序列(1- 818～ 215)与GUS基因构成嵌合质粒pRSSl,将该质粒转化水稻后,在抗性愈伤组织和转基因植株中未能检测到GUS基因的表达.只有用含有完整的内含子及其上游序列(1 818～ 2 844)与GUS基因构成嵌合质粒(p13GNF)时,才能在p13GNF的转基因抗性愈伤组织和植株中检测到GUS基因的表达.实验还证明,单是内含子序列并不能驱动GUS基因在转基因水稻中表达.由此推测:OsBP-73基因的启动子序列驱动基因表达时,需要基因内含子的参与.     

用一种新型基因枪将外源基因转入水稻细胞(简报)(英文)

本文介绍了一种设计上改进的基因枪,用这种新型基因枪将外源基因转移到水稻细胞获得了表达。用包有pBI 121质粒DNA的钨微弹轰击水稻悬浮细胞以及成熟种子胚后,在悬浮细胞中检测到了外源基因(GUS)的表达。胚诱导的愈伤组织在无抗生素选择的条件下扩增并分化、再生,共获得30株绿色小植株。经DNA斑点杂交测得其中两株的植物总DNA中存在GUS基因。Southern杂交分析证实GUS基因整合到了水稻基因组.     

基因枪法导入Bar基因后转化春小麦的幼胚因素

东北农业大学农学院曹颖、胡尚连、李文雄等鉴于基因枪技术不受宿主限制、转化周期短的优点和在单子叶植物遗传转化中广泛应用,他们用Bar基因转化小麦植株,即利用基因枪法将抗除草剂Bar基因导入春小麦东农7742,IE47和辽10,以培养20～22天的幼胚为受体,在80毫微克金枪粉量和6厘米的轰击距离下,基因枪发挥最佳的转化效果。其中有180个幼胚再生出12个植株,有3个呈GUS(基因)阳性,经PCR分析,检测到Bar基因,还证明用高金粉量可以提GUS基因瞬时表达。但金粉密度大,易成块、不能分散,单位面积上靶组织上金粉颗粒数量多,组织易受伤,影响抗性愈…     

插入含Ds因子的T-DNA产生的水稻脆秆突变株的遗传和分子分析

在构建由农杆菌介导的玉米Ds转座因子插入的水稻转化群体中,得到了一个茎秆等组织发生脆性突变的株系。理化指标定量测定表明,脆性株系的载荷强度和纤维素含量都比正常植株低很多,可溶性糖含量略有减少。对这个突变株的分子检测结果表明Ds因子在脆性株系中为单位点插入。检测了自前3代（T1,T2,T3)植株中T-DNA(Ds)插入与脆性表型的共分离关系。初步结果表明这个突变是T－DNA（Ds)的插入造成的,这个突变基因可能与水稻纤维素合成有关。     

抗除草剂草甘膦EPSPs基因在小麦中的转化

通过基因枪法,用抗除草剂草甘膦的ＥＰＳＰｓ基因转化小麦京花１号的幼穗约１０００个,及幼胚约８００个,经草甘膦选择后分别获得３８株和４株再生植株。这些再生植株经ＰＣＲ和（或）Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明,其中有部分再生植株的基因组中稳定整合了外源ＥＰＳＰｓ基因,并且转化体中部分是可育的。首次用实验证明,抗除草剂草甘膦的ＥＰＳＰｓ基因作为单子叶禾谷类作物小麦基因转化的选择标记是行之有效的。     

T—DNA插入水稻群体中卷叶突变体R1—A2的遗传分析

在根癌农杆菌介导的T-DNA(携带有除草剂Basta抗性基因bar和Ds因子)转化中花11水稻群体中,获得了一个叶片发生明显内卷的突变体Rl-A。经过连续三代的分离鉴定,获得突变体的纯合株(Rl-A2),并与中花11号进行杂交,在调查的36个F1植株中,全部表现为卷叶,并对Basta除草剂都表现为抗性。在852个F2单株中,卷叶为645株,正常叶207株,卷叶和正常叶的比例为3：1,其中,卷叶株均对Basta表现抗性,正常叶株均对Basta表现敏感,表明卷叶性状和Basta抗性存在着共分离关系。用扩增DS因子的引物,对F2中45个卷叶抗性株进行PCR鉴定,都获得预期长度的Ds因子片段,进一步表明在这些卷叶的植株中都有T-DNA的插入;而30个正常叶敏感株都不能检测到DS的特征片段。在以卷叶突变(Rl-A2)为回交亲本的F1B1植株中,全部植株表现卷叶;在以中花11号为回交亲本的F1B1植株中,卷叶和正常叶植株的分离比为1：1。上述结果表明该卷叶突变是个显性突变,受一个基因所控制,且该基因的突变与T-DNA的插入有关。     

通过共转化和花药培养快速获得直链淀粉含量降低且无抗性标记的转基因水稻

用根癌农杆菌共转化的方法将p13W8质粒(含反义蜡质基因)和pCAMBIA1300质粒(含潮霉素抗性基因)导入水稻.经PCR检测,发现在29个T1群体中发生抗潮霉素抗性基因和反义蜡质基因的分离;从1 264个T1单株中筛选到183个只带反义蜡质基因片段的转基因植株.选择了4个直链淀粉含量降低的T1单株进行花药培养,获得正常结实的花培苗34株;经PCR检测,有23株为只含反义蜡质基因而无潮霉素抗性基因的植株.从转化到获得直链淀粉含量降低、遗传稳定的转基因植株仅用了一年半时间.