利用Inverse PCR快速筛选单个T—DNA拷贝转基因水稻植株的方法

In order to obtain single T-DNA copy transgenic rice, we have established a quick method to estimate the T-DNA copy number in transgenic rice using inverse PCR (IPCR). IPCR was used to amplify junction fragments, i.e. plant genomic DNA sequences flanking the known T-DNA sequences, which will help to estimate the T-DNA copy number in transgenic rice. We have analyzed 20 transgenic plants of 15 transgenic lines. Most plants (12) contain one integrated T-DNA copy per genome, 3 plants contain two and 1 plant contains 3 copies. In 4 transgenic plants no T-DNA copies could be detected using this method. The IPCR results were further tested by Southern analysis and sequence analysis.     

水稻msp1-4突变体的鉴定及其UDT1和GAMYB基因的表达分析

通过对粳稻‘9522’辐射诱变,得到一隐性雄性不育突变体msp1-4（MULTIPLE SPOROCYTE）,用遗传定位方法将该基因座位定位在分子标记WY-4和WY-8之间,相距0．8cM,物理距离247kb。测序分析证明这247kb区间中的MSP1基因的编码区在第758bp到767bp之间发生了10个碱基的缺失。形态学观察结果表明该突变体和已经报告过的msp1突变体的表型基本一致。为分析水稻其它与花药发育相关的基因在msp1-4中的表达变化,用半定量RT-PCR技术检测到影响绒毡层和花粉发育的重要基因UDT1和GAMYB的表达在突变体中比在野生型水稻中低,说明这2个基因可能位于MSP1基因的下游。     

水稻OsRab5a基因功能的初步分析

水稻OsRab5a基因在根、茎、叶、根茎结合部和颖片及愈伤组织中均有表达;OsRab5a蛋白主要参与细胞内吞过程的早期膜泡运输,GFP—OsRab5a主要存在于细胞膜上和早期内吞小体中,而GFP—OsRab5aCA则大多存在于细胞膜上。OsRab5a RNA干涉载体转化水稻愈伤组织后,导致愈伤组织在分化过程中死亡,OsRab5a基因的表达略受细胞分裂素的诱导,在分化过程中表达增强,从而推测OsRab5a可能参与激素的信号转导而在愈伤分化过程中发挥重要作用。     

利用改进的MutMap方法克隆水稻雄性不育基因

通过对籼稻黄华占EMS(甲磺酸乙酯)诱变, 筛选得到一隐性核不育的水稻雄性不育突变体osms55, 遗传分析表明该突变体为单基因控制的隐性核不育, 采用高通量的Illumina Infinium iSelect SNP(50 K)芯片检测技术鉴定该突变体的遗传背景, 确认该突变体的遗传背景与黄华占一致。文章利用改进的MutMap方法成功克隆该雄性不育基因, 突变位点与突变表型的共分离分析表明LOC_Os02g40450(MER3)是控制osms55突变体雄性不育的基因, 该基因的剪切识别位点发生变异后导致剪切异常, 造成第5外显子缺失15个碱基, 从而产生雄性不育。改进的MutMap方法无需精确组装的野生型基因组序列作对照, 而是通过将定位群体中有突变表型植株的DNA pool和野生型植株DNA的重测序结果分别与日本晴参考基因组进行比对, 然后再比较突变体和野生型的差异SNP来确定候选基因, 该方法大大降低了野生型基因组测序和组装成本, 进一步扩大了MutMap方法的应用范围。     

农杆菌介导转化黑曲霉分生孢子及产孢缺陷突变子T-DNA插入位点分析

【目的】利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA系统,建立转化黑曲霉(Aspergillus niger)分生孢子的方法,构建T-DNA插入突变子文库,为黑曲霉基因组功能注释研究打下基础。【方法】采用携带二元质粒载体pCAMBIA1301的农杆菌EHA105,诱导转化黑曲霉分生孢子,筛选具有潮霉素抗性的突变子。分析抗性稳定突变子菌株的表型,采用反向PCR方法分析T-DNA插入位点相邻位置的序列,并推测突变基因可能具有的功能。【结果】实验获得具有稳定潮霉素抗性转化子193株,转化率为5.6×102转化子/108分生孢子。部分转化子表型出现较为明显改变,其中一株不能产孢,对其T-DNA插入位点序列分析比对结果显示,突变基因属于超级转运家族(major facilitator superfamily,MFS)。【结论】本研究建立的农杆菌转化黑曲霉分生孢子平台,结合T-DNA插入突变位点分析,可以为黑曲霉基因组功能注释研究提供一种简便有效的途径。     

T-DNA标签在转基因水稻基因组中的整合特点

利用热不对称交错PCR (TAIL-PCR),对200个含T-DNA插入的转基因水稻株系进行分析,获得了159个T-DNA右边界侧翼序列. 其中,92个序列含有T-DNA右边界和侧邻的水稻基因组序列,78个序列与已公布的水稻BAC/PAC克隆有97%～100%的同源性,从而可作为T-DNA标签定位在水稻的12条染色体上. 结合先前定位的169个T-DNA标签,对T-DNA在水稻基因组中的整合特点进行了分析. 结果发现,在T-DNA右边界和侧邻的水稻基因组序列的连接处,14.6%的T-DNA标签含有3～74bp的填充序列. 在不含填充序列的连接处,21.3%的T-DNA标签,在整合后的T-DNA右边界与侧翼的水稻基因组序列之间显示出3～5 bp的微同源性. 填充序列和微同源性的存在,揭示了T-DNA在水稻基因组中的整合既存在双链断裂修补机制,又存在单链裂缝修补机制. T-DNA倾向于整合到富含A/T核苷酸的基因组区域,即主要在基因的5′和3′端调控区以及内含子中.     

水稻单C2H2型锌指基因ZOS2-01的表达与功能分析

拟南芥超雄基因(SUPERMAN,SUP)是一个单C2H2锌指基因.该基因突变后会造成雌蕊同源转化为雄蕊,正常的心皮发育受阻,因此SUP在控制花第3/4轮边界的建立和胚珠的发育中起重要作用.为了探知水稻中的SUP同源基因是否也存在类似的功能,我们根据拟南芥SUP的功能结构域,从水稻中克隆了一个与SUP类似基因,命名为ZOS2-01,并对其表达和功能进行了分析.结果表明,ZOS2-01与拟南芥的SUP和矮牵牛的PhSUP1在系统进化树上处于同一分支且与SUP的功能结构域完全相同.定量PCR和GUS表达分析表明,除胚乳外,ZOS2-01几乎在所有组织和器官中表达,但在幼穗中的表达量最高,暗示它可能参与了水稻的营养生长和花器官发育的调节.然而,采用RNA干扰和过量表达的方法减少和增加ZOS2-01的表达并没有明显影响水稻的生长发育,转基因水稻的营养生长正常,花器官发育也没有明显异常且结实正常.这些结果表明,尽管水稻ZOS2-01与拟南芥SUP具有相同的功能结构域,但它们的表达和功能可能已出现了分化,或者水稻中存在多个功能冗余的SUP类似基因.     

通过构建三段T-DNA载体高频率获得无标记转基因大豆植株的研究

高频率获得无选择标记转基因植株有利于转基因植物的环境释放和安全性生产,农杆菌介导的共转化法是获得无标记转基因植株的方法之一。含二段T-DNA载体的共转化法已被人们成功应用,而二段以上T-DNA载体的共转化法还未见报道。基于这一目的,通过几个中间质粒构建了含有三段T-DNA的双元表达载体pNB35SVIP1,其中包含1个拷贝bar基因选择标记基因表达盒和2个拷贝VIP1目的基因表达盒。利用EHA101农杆菌菌系介导法转化大豆子叶节,经过在含3～5mg/L glufosinate培养基上多次筛选,获得了一定数量抗性再生植株,然后对抗性再生植株进行叶片涂抹除草剂、Southern blot和Northern blot检测,共鉴定出51棵T₀代转基因植株,转化频率0.83%～3.16%,二个基因的共转化频率为86.4%。在对T₁代群体进行叶片涂抹除草剂检测的基础上,不抗除草剂植株进行PCR、Southern blot和Northern blot检测,共鉴定出41棵无选择标记转基因植株,无标记植株获得率为7.6%。检测结果还表明,T₁代群体中22.7%的株系发生了基因丢失现象,27.3%的株系发生了bar基因沉默现象,目的基因在37.1%的无标记植株中发生了沉默现象。三段T-DNA的双元表达载体是获得无标记转基因植株的理想途径     

水稻窄叶突变体zy17的遗传分析和候选基因鉴定

器官大小调控是一个基本的发育生物学过程,受细胞分裂和细胞扩展的影响。然而,植物器官大小调控的遗传和分子机理仍不清楚。为了进一步了解器官大小调控的分子机制,文章分离了一系列水稻叶子宽窄改变的突变体。其中,窄叶突变体zy17叶变窄,同时伴有植株矮化、穗子变小、枝梗数和穗粒数降低的表型。遗传分析表明该窄叶性状受1个隐性基因控制;细胞学分析表明该突变体叶子的细胞数目和维管束数目显著降低,表明ZY17影响了细胞分裂。基因组重测序进一步筛选出ZY17的3个候选基因：Os02g22390基因突变发生在内含子区,编码蛋白为逆转座蛋白;Os02g28280和Os02g29530基因突变都发生在外显子区,其中Os02g28280编码一个功能未知蛋白,该基因突变后,发生碱基置换,产生非同义突变;Os02g29530编码一个含糖基转移酶相关的PFAM结构域的蛋白,该基因突变后,出现两个碱基的缺失,从而导致其蛋白翻译提前终止。对候选基因的深入研究,将揭示水稻叶子大小调控的机制。     

水稻RIL群体芽期耐冷性基因的分子标记定位

水稻芽期冷害是我国长江中下游的早稻种植区和东北、西北稻区及云贵高原的一季稻区水稻生产中的重要限制因子之一。研究中利用纸卷法测定1个水稻重组自交系群体对10℃低温的芽期耐冷性,结合1张高密度分子遗传图谱,进行QTL定位分析。检测到控制水稻芽期耐冷性的4个QTL,分别位于1、3、7和11号染色体上。其中,位于11号染色体上的QTL qSCT-11的效应最大,在10℃低温处理13d时,对性状的贡献率达26％～30％,被检测到的LOD值也高达16～19,其加性效应值为正,增效等位基因存在于亲本Lemont中,RM202为与QTL qSCT-11紧密连锁的SSR标记。该主效QTL的增效基因,可作为分子标记辅助选择的操作对象用于水稻芽期耐冷性的遗传改良。     

水稻籼粳杂种雌性不育的细胞学初步观察(简报)

普通栽培稻籼粳亚种间杂种结实率低是开展亚种间杂交育种和杂种优势利用的主要障碍。这一障碍是杂种花粉和胚囊的不育性引起的。不育性曾经认为是两者染色体在结构上存在微小的差异所致,但F_1植株减数分     

水稻亚种间杂种小穗败育的细胞学基础

本文对普通栽培稻不同品种类型间杂种小穗败育的细胞学基础及雌性败育的过程进行了研究,结果表明:(1)引起杂种小穗败育的原因有胚囊败育、花粉败育、开花时花药不开裂和雌雄异熟。其中胚囊败育而丧失受精能力是引起低结实率的最重要的因素,开花时花药不开裂和雌雄异熟在一定程度上形成了雌雄性细胞时间和空间的隔离屏障。(2)杂种植株的所有大孢子母细胞都能进行正常的减数分裂,形成四个大孢子,败育主要发生在靠近合点端的功能大孢子分化形成胚囊的早期,有的功能大孢子在进行第一次有丝分裂前便萎缩解体,多数走向败育的功能大孢子能完成一次或二次有丝分裂,形成二核或四核败育胚囊。败育的共同特征是无液泡的分化,细胞质少或退化,在败育胚囊残迹部位,解体的珠心细胞和萎缩的胚囊残渍混杂垛叠。已受精的杂种子房没有观察到胚及胚乳发育的异常。籼粳杂种胚囊败育频率较高。     

通过荧光差异显示PCR法分离水稻中由ABA调节的基因

脱落酸(ABA)在植物种子发育以及植物细胞对外源环境因子(如逆境、胁迫等)反应过程中起着重要的作用,对其调节基因的分离将有助于了解其相关信号传导途径及作用机制.通过荧光差异显示PCR法我们由水稻中分离了部分ABA调节的cDNA片段,在所分离克隆的17个片段中,有14个片段被ABA诱导(2、4、8、12h),有3个片段被ABA抑制(8h).测序及序列分析表明这些片段可能分别编码与植物光合作用(7)、信号传导(1)、转录调控(2)、代谢(6)相关的蛋白或未知蛋白(1)而且其表达可能受到ABA的调节或ABA参与了其作用,对其中可能编码α/β水解酶折叠蛋白、酪氨酸磷酸酶、液泡H+-ATPase的mRNA进行的RT-PCR和Northern blot分析,确证了ABA对它们表达的调节作用.在此基础上对FDD-PCR技术及ABA作用的可能机制进行了讨论.     

水稻悬浮细胞的超低温保存研究

本研究分析了水稻悬浮细胞的生理状态和各种冷冻前处理等因素对超低温保存后细胞存活率的影响。结果表明,继代后培养3—5天,处于对数生长期的细胞,采用二步冷冻法,超低温保存后存活率最高。电镜超微结构观察显示,0.5mol/L山梨醇预培养,10%DMSO 0.5mol/L山梨醇复合保护剂处理,液泡显著变小,数目明显减少,从而降低了细胞内自由水含量,增强细胞的抗冷冻能力。在上述合适的前处理和冷冻-化冻条件下,超低温保存水稻悬浮细胞的恢复生长率为58%,恢复生长的细胞转移到分化培养基上,可再生健壮绿苗, 移植到盆钵,在温室中长成正常结实的植株。     

水稻胚胎发育与萌发过程中凝集素的生物合成及其对转录与翻译抑制剂的敏感性

稻胚凝集素(RGL)在开花后7—13天之间合成活性很强,15天以后明显下降。7—13天之间RGL合成相当旺盛是由于这一时期编码RGL的mRNA得到迅速转录,而在开花后15—30天之间以及萌发4小时内RGL的合成主要是由胚分化发育期间(7—13天)所形成的mRNA所指导的。RGL主要在水稻胚胎发育过程中合成、积累,在萌发过程中几乎不表达,所以RGL是胚胎特异的蛋白质。     

水稻籼粳杂种F_1雌配子体败育的超微结构和酸性磷酸酶细胞化学研究(简报)

籼粳稻亚种间杂交是获得强优势种的有效途径之一。但主要存在如何克服杂种F_1结实率低的问题。影响F_1结实率的因素是很复杂的,部分胚囊败育而丧失授精能力是其中的主要原因。因此阐明籼粳杂种雌配子体败育的机理,成了当前籼粳亚种杂交优势利用研究的重要课题之一。目前对籼粳杂种雌配子体败育的细胞学研究特别是超微结构方面的研究不多。Oka和Doida观察到败育发生在大     

T-DNA插入水稻群体中卷叶突变体R1-A2的遗传分析

在根癌农杆菌介导的T-DNA(携带有除草剂Basta抗性基因bar和Ds因子)转化中花11水稻群体中,获得了一个叶片发生明显内卷的突变体R1-A。经过连续三代的分离鉴定,获得突变体的纯合株(R1-A2),并与中花11号进行杂交,在调查的36个F_1植株中,全部表现为卷叶,并对Basta除草剂都表现为抗性。在852个F_2单株中,卷叶为645株,正常叶207株,卷叶和正常叶的比例为3:1,其中,卷叶株均对Basta表现抗性,正常叶株均对Basta表现敏感,表明卷叶性状和Basta抗性存在着共分离关系。用扩增Ds因子的引物,对F_2中45个卷叶抗性株进行PCR鉴定,都获得预期长度的Ds因子片段,进一步表明在这些卷叶的植株中都有T-DNA的插入;而30个正常叶敏感株都不能检测到Ds的特征片段。在以卷叶突变(R1-A2)为回交亲本的F_1B_1植株中,全部植株表现卷叶;在以中花11号为回交亲本的F_1B_1植株中,卷叶和正常叶植株的分离比为1:1。上述结果表明该卷叶突变是个显性突变,受一个基因所控制,且该基因的突变与T-DNA的插入有关。     

水稻淀粉胚乳程序性细胞死亡中的去核化

对水稻品种中籼8836淀粉胚乳细胞的去核化发育阶段的细胞超微结构变化和同期籽粒灌浆速率及相关酶活性的动态进行了观察和分析。开花受精后约在第3天胚乳完成细胞化,花后第5天少数淀粉胚乳细胞启动去核发育过程。核消亡是淀粉胚乳细胞程序性细胞死亡(PCD)的第一步。同一籽粒淀粉胚乳细胞的去核进程是不同步的。花后第13天所有淀粉胚乳细胞都已完成去核过程。在去核过程中,胚乳核的形态变化特征既有动植物PCD的共性又有其特殊性。伴随核降解过程,一部分线粒体解体,表明去核化与线粒体解体有一定联系。在去核化发育阶段,与PCD有关的酶类,如超氧化物歧化酶(SOD)过氧化氢酶(CAT)活性非常高;与淀粉合成有关的酶类,如ADPG焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶(SSS酶)、淀粉分支酶(或Q酶)也表现出很高的活性。去核化发育阶段籽粒灌浆速率最高,籽粒增重亦最快。淀粉胚乳细胞去核之后,细胞并未立即死亡,这些无核的细胞仍维持正常有序的代谢活动,继续进行淀粉和贮藏蛋白的合成与积累,但上述酶类的活性明显降低,灌浆速率也明显趋缓。淀粉胚乳细胞最终被贮藏物质充满时成为死细胞,完成其程序性死亡过程。Evan’s blue染色鉴定表明淀粉胚乳细胞死亡不同步,细胞死亡在淀粉胚乳组织中是随机发生的。     

农杆菌介导的水稻双载体共转化法中部分影响因素的研究

以T-DNA区分别只含有潮霉素选择标记基因(HPT)和GUS报告基因的双元载体pCAMBIA1300和pCAMBIA0301用于农杆菌介导的水稻共转化试验。根据经农杆菌浸染并共培养3d后水稻愈伤组织中的GUS瞬间表达情况及其稳定共转化率,测定了不同农杆菌菌株搭配及其不同浓度配比对共转化效率的影响。结果表明,在两种农杆菌菌液浓度比为1:1的情况下,农杆菌EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA0301组合共转化水稻的效率要高于其他菌株的组合;在以农杆菌EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA0301进行共转化时,两种菌液浓度比为1:2时共转化效率最高。     

从水稻花粉管分离精细胞(简报)

精细胞的分离是植物生殖工程的一个重要组成部分,是目前被子植物有性生殖研究的一个活跃领域[1,2]。随着精细胞分离技术的完善和分离出精细胞的植物类型的增加,目前对精细胞的分子生物学研究已有一些进展,主要是精细胞特异蛋白的分离[3,4]和cDNA文库的构建以及一些精细胞特异基因的分离[5,6]。