大肠杆菌O157∶H7感染流行概况

大肠杆菌O157∶H7是肠出血性大肠杆菌的主要病原血清型,可引起腹泻、出血性肠炎,极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜两种严重的并发症,死亡率高。1982年被发现以来,大肠杆菌O157∶H7已在世界多个国家引起过爆发流行,呈现了流行的世界性,中国也于上世纪90年代末在局部地区出现了爆发,死亡率极高,引起了相关部门的高度重视。本综述试图通过对大肠杆菌O157∶H7在世界范围流行状况的描述,提高公众对该病的认识,为相关疫苗的研发提供流行病学资料。     

Tir细胞骨架偶联蛋白:大肠杆菌O157：H7的一种新的毒力因子

肠出血性大肠杆菌O157:H7是一种重要的传染性病原菌,可引起多种致死性疾病的爆发流行。Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)是近年来发现的O157:H7的一种新的重要的毒力因子,在O157:H7黏附宿主细胞造成黏附擦拭(A/E)损伤过程中起重要作用,TccP相关研究对阐明O157:H7致病机制具有重要意义。     

变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌

应用多重PCR 反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测方法.以编码沙门氏菌的fimY基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码肠出血性大肠杆菌O157:H7的rfbE基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了快速鉴别沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为284、159和499 bp,并验证了该多重PCR具有特异性.沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:沙门氏菌1.5 CFU/ml、空肠弯曲菌15 CFU/ml、肠出血性大肠杆菌O157:H7 15 CFU/ml.在随机采集的226份冷冻鸡肉类样品中,检出了7份样品为沙门氏菌阳性、10份为空肠弯曲菌阳性、1份为肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性.研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测.     

肠出血性大肠杆菌O157：H7监测及分析

为了了解长春地区动物和人感染肠出血性大肠杆菌O157H7状况,建立流行病学监测网.采集长春市动物养殖场动物粪便和腹泻病人便样进行监测.结果在牛粪和鸡粪中共检出2株O157H7大肠杆菌.可见,在长春地区存在肠出血性大肠杆菌O157H7菌潜在污染的威胁,需要加强监测力度.     

大肠杆菌O157:H7的毒力岛与毒力因子的研究进展

大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠埃希菌的主要血清型,能引起人的出血性肠炎和溶血性尿路综合征。大肠杆菌O157:H7致病机制与其毒力岛编码的毒力因子有关,这些毒力岛包括染色体上的LEE岛、前噬菌体上的slt基因、大质粒上的hly、ka tP、espP、toxB、stcE基因。大肠杆菌O157:H7致病机理不是由单一毒力因子所决定,而是多种毒力因子共同作用的结果。     

大肠杆菌O157:H7的sRNA伴侣蛋白Ufq的基因克隆、表达及纯化

目的:克隆、表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的sRNA伴侣蛋白Hfq.方法:利用PCR方法从EHEC O157:H7基因组中扩增出基因hfq,并插入含6xHis标签序列的原核表达载体pET28a(+)的多克隆位点中,构建重组表达质粒pET28a(+)-hfq,以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)...     

肠出血性大肠杆菌毒力相关基因突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、espB、espD,构建3株突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增基因两翼的同源序列;将PCR产物插入pEASY-T1载体并测序,将测序正确的上、下游同源序列分步酶切,构建于pUC19-kan质粒上,经PCR获得两端同源序列中间嵌合卡那霉素抗性基因标记的线性片段,利用质粒pKD46介导的重组技术,敲除espA、espB、espD基因,之后转入pCP20质粒以去除抗性标记,最后测定突变株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、es pB、espD,获得3株突变株,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:为进一步研究espA、espB、espD基因在肠出血性大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7紧密粘附素免疫保护性片段（Intimin-C）的克隆表达纯化及部分生物学活性研究

克隆表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7紧密粘附素免疫保护性片段(Intimin-C),并对其部分生物学活性进行研究.     

大肠杆菌O157:H7 sRNA基因E40缺失突变株的构建

目的:利用Red系统构建肠出血性大肠杆菌O157:H7的sRNA基因E40缺失突变株。方法:选取本实验室预测并经过实验验证的sRNA基因,根据NCBI上相应的序列,设计2对引物分别扩增该sRNA基因的上下游分别长464和455bp的同源臂,经PCR扩增,构建到相应的载体,最后以构建好的含上下游同源臂和卡那霉素抗性基因的长约2500bp的线性片段作为打靶片段,在Red重组系统的作用下与sRNA基因E40的上下游同源区域发生同组,从而把sRNA基因从基因组上置换下来,之后利用质粒pCP20将FRT位点间的卡那霉素抗性基因消除。结果与结论:构建了出血性大肠杆菌O157:H7的sRNA基因E40的缺失突变株,为进一步研究sRNA基因在出血性大肠杆菌O157:H7生长及致病过程中所起的功能奠定了良好的基础。     

肠出血性大肠杆菌Ⅲ型分泌系统ATP水解酶escN基因突变株的构建

目的:利用λ噬菌体的Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的Ⅲ型分泌系统ATP水解酶Esc N,构建大肠杆菌esc N基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别酶切连接于p UC19-kan质粒上,PCR获得中间嵌合卡那霉素抗性基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46和p CP20介导的重组技术敲除esc N基因,并去除抗性标记;PCR及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的esc N基因,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:构建了Ⅲ型分泌系统缺陷菌株,为进一步研究Ⅲ型分泌系统因子在肠出血性大肠杆菌致病过程中的作用奠定了基础。     

大肠杆菌O157:H7致病因子及其保护性免疫研究现状

大肠杆菌O157:H7是肠出血型大肠杆菌(EHEC)的主要病原血清型,它可产生特殊的粘附因子粘附靶细胞,产生Vero毒素和肠溶血素毒力因子.近几年对大肠杆菌O157:H7的毒力因子有了深入的了解,对致病机理作了一些探讨,用实验动物对保护性免疫进行了研究.本文对近几年来0157:H7大肠杆菌的致病因子及其主要的保护性免疫的研究作一简要综述.     

大肠杆菌O157:H7核酸探针检测方法的建立

目的：应用核酸探针方法快速检测大肠杆菌O157：H7。方法：通过使用吖啶酯标记的特异DNA探针方法检测大肠杆菌O157：H7,对此种方法的特异性、敏感性、准确性进行研究,比较该方法与传统国标法的检测结果。结果：核酸探针方法检测大肠杆菌O157：H7特异性以及敏感性强,检出大肠杆菌O157：H7菌液浓度最低限约为106cfu/ml,检测大肠杆菌O157：H7的结果与国标法相一致;对O157：H7鉴定时间仅需30min,简便快捷。结论：核酸探针方法可用于大肠杆菌O157：H7的快速检测。     

大肠杆菌O157显色培养基检测效果的评价

【目的】评价显色培养基对大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)的检测效果。【方法】本实验室研制的大肠杆菌O157显色培养基(HKM),与国外梅理埃、科玛嘉及国内厂家的同类产品及传统培养基CT-SMAC作比较,对相关菌株以及污染样品和实际样品进行对比测试。【结果】实验室研制的HKM大肠杆菌O157显色培养基与科玛嘉同类产品在特异性、灵敏度及检测效果方面均无明显差异,均优于梅里埃、国内厂家产品及CT-SMAC。【结论】HKM大肠杆菌O157显色培养基具有高检出率及高特异性的特点,具有较好的应用价值和前景。     

利用串联亲和纯化技术分离大肠杆菌GroEL蛋白复合物

肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的致病菌,加深其致病机理的基础研究将为相关疫苗研究及疾病控制等提供新的思路和依据.串联亲和纯化(TAP)技术是最近发展的分离纯化天然状态蛋白质复合物进而研究蛋白质相互作用的新方法.用我们自己构建的原核表达串联亲和标签载体,在大肠杆菌O157∶H7中表达了标签融合蛋白GroEL-TAP,建立了非变性条件下制备蛋白复合物的方法,并且对串联亲和纯化过程中的相关实验条件进行了探索和优化,最终得到了高纯度的GroEL-TAP与天然GroEL形成的嵌合型多聚体复合物.这表明我们建立的串联亲和纯化技术能高度特异地纯化靶蛋白参与形成的复合物,为后续寻找O157∶H7中毒力蛋白参与形成的复合物奠定了实验基础.     

用含10%胎牛血清的DMEM培养肠出血性大肠杆菌O157∶H7可增强其对HeLa细胞的黏附/擦拭损伤

目的:研究生长在不同培养基中的肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7对宿主细胞造成的黏附/擦拭损伤是否存在差异。方法:分别用LB、DMEM、DMEM(含10%胎牛血清)、DMEM(含终浓度为25mmol/L的HEPES)等4种培养基培养O157∶H7,然后感染HeLa细胞,利用Giemsa染色观察细菌黏附差异,进行肌动蛋白荧光染色实验并观察宿主细胞肌动蛋白聚集差异。结果:在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养EHECO157∶H7,其黏附力增加,聚集细胞骨架肌动蛋白的能力明显增强。结论:为进一步研究EHECO157∶H7的致病性,探索O157∶H7新的致病因子奠定了基础。     

出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株的构建及其免疫

出血性大肠杆菌O157感染是重要的新发食物源性传染病,主要致病特征之一是能引起人肠上皮细胞特征性的A/E损伤,A/E损伤主要是由LEE致病岛所编码的毒力因子所引起,ler是LEE致病岛毒力基因群的中心调节基因,对LEE致病岛所编码的毒力因子有正调控作用。O157:H7另一个毒力因子是由整合到染色体上的原噬菌体编码的Stx毒素。以O157:H786-24为始发菌株,利用自杀性质粒pCVD442和同源重组的原理构建了O157:H7的ler基因缺失突变菌株(缺失了ler基因中第73-351位的碱基,共279bp),并利用噬菌体消除技术筛选到消除了编码Stx的原噬菌体DNA的菌株,构建出了O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株,并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明,O157:H7ler/stx基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用,并丧失了对实验小鼠的致病性,具有良好的安全性。乳鼠被动免疫保护性实验表明,用该菌株免疫母鼠后,乳鼠通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株可作为预防EHEC O157:H7感染的疫苗候选株,为最终研究制出O157的基因工程菌苗奠定基础。     

肉类中大肠杆菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

以编码大肠杆菌O157抗原的rfbE基因、 编码H7抗原的fliC基因以及编码毒力因子的eaeA基因为靶基因, 选择3对引物, 建立并优化了检测大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系, 扩增产物分别为291 bp、625 bp、368 bp, 采用30株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到91.35 pg; 在存在干扰菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella?typhimurium)的情况下, 当起始污染量为1.4 CFU/mL时, 37 ℃培养6 h 即可检出。在30份肉类样品中, 有3份检出了大肠杆菌O157:H7。本研究建立的多重PCR方法可特异、灵敏地实现对大肠杆菌O157:H7的检测。     

大肠杆菌变种的两种分子生物学检测方法分析

目的:对大肠杆菌的一种重要的变种--肠出血性大肠杆菌O157-H7的几种检测方法进行比较研究.方法:以自动免疫磁珠收集系统(AIMS)、自动酶标免疫测试系统(VIDAS)与传统常规的分离方法进行对比分析.结果:运用自动免疫磁珠收集系统(AIMS)方法对80份可能含有肠出血性大肠杆菌O157-H7的实样进行检测,检出份数为6份,检出率为7.5％,而且在一周之内可以全部对上述检出实样进行鉴定.AIMS法能够检出浓度在10cfu/mL模拟实样之中的肠出血性大肠杆菌O157-H7,然后将此法与CHROMagar 0157琼脂板相结合,其效果则更为明显.而自动酶标免疫测试系统(VIDAS)与传统与的分离方法则检测的效果不佳,检出率为0.自动免疫磁珠收集系统(AIMS)检测方法与自动酶标免疫测试系统(VIDAS)、传统与的分离方法在检出率方面存在显著的统计学差异,P＜0.01.结论:运用自动免疫磁珠收集系统(AIMS)结合CHROMagar 0157琼脂板对出血性大肠杆菌O157-H7进行检测,检出率较高、灵敏度较高且快速便捷,可以用于O157-H7外环境检测与食品污染源的实际调查之中,应该对其加以广泛地推广并应用.     

改良环介导等温扩增技术快速检测肉类中的大肠杆菌O157: H7

针对大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7,E.coli O157:H7)传统检测方法检测周期长的问题,建立了肉类中的E.coli O157:H7的改良环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法。以E.coli O157:H7的O157特异性抗原rfbE基因、鞭毛H7特异性抗原fliC基因序列作为靶序列,分别设计2套增加了环引物的改良LAMP引物序列,单管同时检测,通过肉眼观察白色沉淀,判断检测结果。采用36株细菌验证了该改良LAMP引物的特异性。热裂解法提取的DNA经改良LAMP体系扩增20 min,检测E.coli O157:H7的灵敏度为1.4 CFU/mL,人工污染肉中的E.coli O157:H7检出限为1.8 CFU/g。137份实样中,检测出1份E.coli O157:H7假阳性,与行业标准SNT0973-2000符合率达到99.3%。     

肉类中大肠杆菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

以编码大肠杆菌 O157 抗原的 rfbE 基因、编码 H7 抗原的 fliC 基因以及编码毒力因子的eaeA 基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了检测大肠杆菌 O157:H7 的多重 PCR 体系,扩增产物分别为291 bp、625 bp,368 bp,采用30株细菌验证了该多重 PCR 具有特异性.PCR 检测的灵敏度在 DNA 水平上达到91.35 Pg;在存在干扰菌鼠伤寒沙门氏(Salmonella typhimurium)的情况下,当起始污染量为1.4 CFU/mL时,37℃培养6 h即可检出.在30份肉类样品中,有3份检出了大肠杆菌 O157:H7.本研究建立的多重 PCR 方法可特异、灵敏地实现对大肠杆菌 O157:H7 的检测.