肠出血性大肠杆菌毒力相关基因突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、espB、espD,构建3株突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7为模板,PCR扩增基因两翼的同源序列;将PCR产物插入pEASY-T1载体并测序,将测序正确的上、下游同源序列分步酶切,构建于pUC19-kan质粒上,经PCR获得两端同源序列中间嵌合卡那霉素抗性基因标记的线性片段,利用质粒pKD46介导的重组技术,敲除espA、espB、espD基因,之后转入pCP20质粒以去除抗性标记,最后测定突变株及野生菌株的生长曲线。结果:敲除了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的毒力基因espA、es pB、espD,获得3株突变株,突变株与野生株的生长曲线相近。结论:为进一步研究espA、espB、espD基因在肠出血性大肠杆菌O157∶H7致病过程中的作用奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 z1445基因缺失株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7的z1445基因,构建大肠杆菌z1445基因缺失突变株。方法:以O157∶H7为模板,PCR扩增目的基因两侧的同源臂序列,分别经酶切后连接到p UC19-kan质粒的卡那霉素抗性基因kan两侧,PCR获得中间嵌合kan基因(带有FRT位点)的同源线性片段,利用质粒p KD46敲除z1445基因,利用质粒p CP20去除抗性标记基因;PCR鉴定及测序验证目的基因缺失后,测定缺失株及野生株的生长曲线。结果:敲除了z1445基因,突变株与野生株的生长曲线接近。结论:构建了z1445基因缺陷型菌株,为进一步分析z1445基因在O157∶H7与宿主的相互作用中发挥的作用提供了材料。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7前噬菌体CP-933Y缺失突变株的构建

目的:利用Red重组系统敲除肠出血性大肠杆菌O157∶H7前噬菌体片段CP-933Y,进而构建CP-933Y缺失突变株。方法:以肠出血性大肠杆菌O157∶H7菌株为模板,加入酶切位点PCR扩增前噬菌体CP-933Y上、下游各600 bp的同源臂序列;酶切后分别连接到p UC19-kan质粒的卡那霉素(包含FRT位点)抗性基因两侧,构建中间是卡那霉素抗性基因标记含有目的基因上、下游同源序列的线性片段;导入含有p KD46质粒的O157∶H7菌株中,利用Red编码的同源重组酶使该片段与目的基因上、下游发生同源重组,卡那霉素抗性基因置换菌株中CP-933Y前噬菌体片段,最后导入p CP20质粒去除卡那霉素抗性标记基因。结果:经PCR及测序验证,O157∶H7菌株中前噬菌体片段CP-933Y被敲除,敲除株与野生株具有相似的生长曲线。结论:构建了大肠杆菌O157∶H7前噬菌体CP-933Y缺失株,为进一步研究前噬菌体CP-933Y的功能奠定了基础。     

大肠杆菌O157:H7 sRNA基因E40缺失突变株的构建

目的:利用Red系统构建肠出血性大肠杆菌O157:H7的sRNA基因E40缺失突变株。方法:选取本实验室预测并经过实验验证的sRNA基因,根据NCBI上相应的序列,设计2对引物分别扩增该sRNA基因的上下游分别长464和455bp的同源臂,经PCR扩增,构建到相应的载体,最后以构建好的含上下游同源臂和卡那霉素抗性基因的长约2500bp的线性片段作为打靶片段,在Red重组系统的作用下与sRNA基因E40的上下游同源区域发生同组,从而把sRNA基因从基因组上置换下来,之后利用质粒pCP20将FRT位点间的卡那霉素抗性基因消除。结果与结论:构建了出血性大肠杆菌O157:H7的sRNA基因E40的缺失突变株,为进一步研究sRNA基因在出血性大肠杆菌O157:H7生长及致病过程中所起的功能奠定了良好的基础。     

利用Red重组系统敲除大肠杆菌 O157:H7的waaL 基因

目的:利用λ噬菌体Red重组系统敲除大肠杆菌O157:H7的waaL基因。方法:以pKD4为模板扩增出与waaL基因上下游同源的、含有卡那霉素抗性基因的PCR产物。然后电击转化到大肠杆菌 O157:H7 中,利用Red重组系统,通过卡那霉素抗性基因两侧的waaL基因序列在体内与waaL基因发生同源重组,置换了 O157:H7 基因组中的waaL基因。并进一步利用卡那霉素抗性基因两侧的FRT位点,通过FLP位点专一性重组将卡那霉素抗性基因敲除。结果:成功构建了敲除waaL基因且不带卡那霉素抗性基因的菌株。     

pilO基因对鲍曼不动杆菌运动能力的影响

目的:构建无标记的鲍曼不动杆菌pil O基因缺失突变株,通过表型鉴定pil O基因缺失对鲍曼不动杆菌运动能力的影响。方法:PCR扩增pil O基因上下游各1 kb同源臂,连接至p MO130-TelR自杀质粒,质粒转化大肠杆菌S17-1后再接合至鲍曼不动杆菌4294中;蔗糖诱导自杀质粒与基因组同源重组,以获得基因缺失突变株;蹭行实验观察pil O基因缺失对鲍曼不动杆菌运动能力的影响。结果:构建了pil O基因缺失鲍曼不动杆菌4294菌株突变株;缺失株与野生株生长曲线无明显差异,但蹭行能力显著下降。结论:pil O基因与细菌蹭行能力密切相关,提示其编码鲍曼不动杆菌Ⅳ型菌毛结构蛋白。     

λRed重组系统用于沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株的构建

[目的]利用λRed重组系统敲除沙门菌质粒毒力基因spvC。[方法]首先以质粒p KD4为模板,扩增得到两侧含spvC同源臂、中间为卡那霉素抗性基因的线性DNA片段。再将此线性片段电转入具重组功能的感受态沙门菌菌株,发生重组后,卡那霉素平板筛选阳性转化子。最后利用表达FLP重组酶的质粒p CP20,将FRT位点之间的卡那霉素抗性基因消除,用PCR鉴定。Western Blot检测野生沙门菌和spvC敲除株感染的He La细胞ERK磷酸化水平。[结果]沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株构建成功,spvC敲除株感染的He La细胞内ERK磷酸化水平升高。[结论]成功构建沙门菌质粒毒力基因spvC敲除株,验证了spvC基因的功能。     

基因编辑技术对大肠杆菌yjjW基因点突变的两步法策略

【目的】为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变,本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合,探索一种高效、简捷的两步法策略。【方法】将靶基因的上下游同源臂和标记基因(amp)与pKOV质粒连接,获得pKOV-HR重组质粒。将pKOV-HR转化至大肠杆菌,借助其自身RecA重组系统,介导DNA发生同源重组,获得靶基因敲除菌株。随后,靶基因的点突变采用pSGKP-km和pCasKP-apr双质粒系统。首先,设计与amp结合具有定向引导作用的spacer序列,并利用overlap PCR获得带有靶基因点突变的同源臂,将spacer和同源臂与pSGKP-km质粒连接,获得重组质粒pSGKP-km-spacer-HR;接着,将pSGKP-km-spacer-HR和pCasKP-apr质粒转化至上述敲除菌株;最后,利用质粒表达的Cas9切割蛋白和λ-Red重组蛋白,发生DNA同源重组,获得靶基因点突变菌株。【结果】利用上述方法,既成功获得了大肠杆菌yjjW敲除菌株D7ΔyjjW::ampR,又实现了yjjW第24位碱基T到C的点突变,获得点突变菌株D7yjjW-24。【结论】本研究建立了一种高效、简捷的大肠杆菌靶基因点突变方法,amp基因的插入提供了有效的筛选标记,此外该方法建立的重组质粒pSGKP-km-spacer,可应用于同种菌株其他靶基因的点突变,能够缩短后续实验操作,为基因编辑技术的发展提供了科学理论以及实验操作基础。     

出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株的构建及其免疫

出血性大肠杆菌O157感染是重要的新发食物源性传染病,主要致病特征之一是能引起人肠上皮细胞特征性的A/E损伤,A/E损伤主要是由LEE致病岛所编码的毒力因子所引起,ler是LEE致病岛毒力基因群的中心调节基因,对LEE致病岛所编码的毒力因子有正调控作用。O157:H7另一个毒力因子是由整合到染色体上的原噬菌体编码的Stx毒素。以O157:H786-24为始发菌株,利用自杀性质粒pCVD442和同源重组的原理构建了O157:H7的ler基因缺失突变菌株(缺失了ler基因中第73-351位的碱基,共279bp),并利用噬菌体消除技术筛选到消除了编码Stx的原噬菌体DNA的菌株,构建出了O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株,并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明,O157:H7ler/stx基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用,并丧失了对实验小鼠的致病性,具有良好的安全性。乳鼠被动免疫保护性实验表明,用该菌株免疫母鼠后,乳鼠通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O157:H7ler/stx基因缺失突变弱毒菌株可作为预防EHEC O157:H7感染的疫苗候选株,为最终研究制出O157的基因工程菌苗奠定基础。     

变性高效液相色谱检测沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌

应用多重PCR 反应(multiplex PCR,mPCR)结合变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术建立食品中沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测方法.以编码沙门氏菌的fimY基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码肠出血性大肠杆菌O157:H7的rfbE基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了快速鉴别沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系,扩增产物分别为284、159和499 bp,并验证了该多重PCR具有特异性.沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7标准菌株稀释成不同梯度,做灵敏度检测.试验结果表明该方法有很好的特异性,且灵敏度高,检测限可达到:沙门氏菌1.5 CFU/ml、空肠弯曲菌15 CFU/ml、肠出血性大肠杆菌O157:H7 15 CFU/ml.在随机采集的226份冷冻鸡肉类样品中,检出了7份样品为沙门氏菌阳性、10份为空肠弯曲菌阳性、1份为肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性.研究建立的多重PCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对沙门氏菌、空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速检测.     

炭疽芽胞杆菌mntA基因缺失突变株的构建及鉴定

目的:通过同源重组的方法敲除炭疽芽胞杆菌减毒AP422株的mntA基因,使菌株进一步减毒,用于构建新的疫苗候选株。方法:利用PCR方法扩增mntA基因上下游同源臂后与温敏质粒连接,构建打靶载体,并转化炭疽芽胞杆菌减毒AP422株;利用抗生素和温度2种选择压力实现同源重组,敲除目标基因mntA,然后利用Cre-LoxP系统去除抗性筛选标记,得到无抗性标记的缺失突变株,并利用PCR和Western印迹等方法对重组菌进行系统鉴定,最后分析突变株的生物学性状。结果:敲除了AP422株的mntA基因,获得了无抗性标记的缺失突变株,突变株的生存竞争能力比原始菌株明显减弱。结论:突变株获得了进一步减毒,可用于构建新的疫苗候选株。     

金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因(nos)缺失突变株的构建

目的：构建金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因（nos）缺失突变株。方法从金黄色葡萄球菌RN6390的基因组DNA中扩增了nos基因的上、下游片段;以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌穿梭质粒pMAD（含有温度敏感性的复制起点,红霉素抗性基因（erm）和B．半乳糖苷酶基因（bgaB）为筛选标记）为骨架,构建基于nos基因位点的同源重组载体pMADAnos,该载体经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再转入金黄色葡萄球菌RN6390。经过在30℃和42℃交替培养,通过抗生素抗性和β-半乳糖苷酶活性筛选nos基因缺失突变株。结果筛选得到的突变菌株,经基因组PCR、定量PCR及序列分析表明,金黄色葡萄球菌RN6390基因组中的nos基因被成功地敲除。结论利用同源重组的方法构建了金黄色葡萄球菌RN6390nos缺失突变株,为金黄色葡萄球菌nos基因功能的研究奠定了基础,     

猪链球菌2型Ⅳ型分泌系统组分VirD4与毒力相关性分析

摘要:【目的】构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33毒力岛89 K上的Ⅳ型分泌系统组分VirD4敲除突变株,初步分析其活性和毒力,为进一步研究猪链球菌2 型在逃避宿主天然免疫杀伤中的作用提供基础。【方法】以05ZYH33基因组为模板,PCR扩增VirD4基因上下游同源臂,以穿梭质粒pSET1为模板,PCR扩增氯霉素抗性基因Cm,通过重叠PCR技术搭建上述3个片段并连接至温敏载体pSET4s,构建基因敲除载体pSET4s∷VirD4;通过同源重组构建基因敲除突变株ΔVirD4;通过体外全血杀伤实验、CD1小鼠竞争感染及攻毒实验 对突变株和野生株的毒力进行比较分析。【结果】获得了基因敲除突变株ΔVirD4,通过对比发现其毒力与野生株相比有所降低。【结论】猪链球菌2型Ⅳ型分泌系统组分VirD 与其毒力相关,并在早期抵抗天然免疫细胞杀伤中发挥一定作用。     

高致病性2型猪链球菌Ⅳ型样分泌系统virB1-89K基因的敲除及其对毒力的影响

[目的]构建高致病性2型猪链球菌Ⅳ型样分泌系统vir B1-89K基因的敲除株和互补株,研究vir B1-89K基因缺失对细菌毒力的影响.[方法]通过同源重组技术敲除vir B1-89K基因,多重PCR筛选敲除株并测序鉴定.再将virB1-89K基因克隆到穿梭质粒pSET1后转入vir B1-89K敲除株中,构建互补株.比较野生株05ZYH33、突变株△virB1-89K和互补株CvirB1-89K三者基本生物学特性的差异,小鼠实验分析virB1-89K基因敲除后对细菌毒力的影响.[结果]成功构建突变株△vir B1-89K和互补株CvirB1-89K,在基本生物学性状无明显改变的情况下,敲除株的毒性降低到野生株的30％,互补株可恢复其毒性.[结论]virB1-89K基因作为2型猪链球菌高致病性菌株05ZYH33的Ⅳ样分泌系统的重要组分,与其高致病性密切相关.     

大肠杆菌menA敲除对CoQ积累的影响研究北大核心CSCD

通过同源重组敲除大肠杆菌的men A基因,增加菌体Co Q合成量,用于构建Co Q高产菌株。以p KD4质粒为模板,PCR扩增kanr片段;在p KD46的辅助下,kanr片段转化大肠杆菌,利用抗生素筛选和PCR验证重组子;以紫外诱变菌为对照,发酵men A基因敲除菌株,分析Co Q种类和产量变化。成功获得men A基因敲除菌株,Co Q种类不变,产量增加约为38%。首次敲除men A基因,改良株Co Q产量得到提高,达到预期目标。     

Pseudomonas plecoglossicida NyZ12基因无痕敲除方法的建立

旨在建立一种适合环己胺降解菌NyZ12基因无痕敲除的可靠方法。通过overlapping PCR技术将目的基因上下游同源臂融合并克隆到自杀载体pEX18km上,将重组质粒转化到大肠杆菌S17pir中,再通过接合转移到假单胞菌NyZ12菌株内,经pEX18km质粒上sacB基因的反向筛选得到突变株并通过PCR方法和测序鉴定。结果显示,成功构建了假单胞菌NyZ12菌株orf4637的基因突变株(NyZ12Δ4637)。通过自杀载体同源重组可以成功获得敲除的无痕突变株,且突变株基因组上没有任何抗性筛选标记残留,为环己胺降解菌NyZ12基因功能研究提供了可靠的基因敲除技术。     

出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株的构建及其免疫

出血性大肠杆菌O157感染是重要的新发食物源性传染病,主要致病特征之一是能引起人肠上皮细胞特征性的A/E损伤,A/E损伤主要是由LEE致病岛所编码的毒力因子所引起,ler是LEE致病岛毒力基因群的中心调节基因,对LEE致病岛所编码的毒力因子有正调控作用。O157:H7另一个毒力因子是由整合到染色体上的原噬菌体编码的Stx毒素。以O157:H7 86-24为始发菌株,利用自杀性质粒pCVD442和同源重组的原理构建了O157:H7的ler基因缺失突变菌株（缺失了ler基因中第73-351位的碱基,共279bp）,并利用噬菌体消除技术筛选到消除了编码Stx的原噬菌体DNA的菌株,构建出了O157:H7 ler/stx基因缺失突变弱毒菌株,并对该菌株的Vero细胞毒性、小鼠模型的安全性以及乳鼠的被动免疫保护作用进行了研究。结果表明,O157:H7 ler/stx基因缺失突变菌株丧失了对Vero细胞的毒性作用,并丧失了对实验小鼠的致病性,具有良好的安全性。乳鼠被动免疫保护性实验表明,用该菌株免疫母鼠后,乳鼠通过吸吮母乳可以获得良好的被动免疫保护作用。因此本研究所构建的O157:H7 ler/stx基因缺失突变弱毒菌株可作为预防EHEC O157:H7感染的疫苗候选株,为最终研究制出O157的基因工程菌苗奠定基础。     

集胞藻PCC6803中基因slr1761突变体的构建

PCR扩增了集胞藻PCC6803的slr1761基因,进一步以PGEM-T为载体将其克隆到大肠杆菌中,构建了P1761质粒。通过DNA体外重组,以卡那霉素抗性基因插入目的基因片段,构建了既含目的基因上游及下游序列、又携带选择性标记卡那霉素抗性的PK1761质粒。该质粒转化野生型集胞藻PCC6803细胞,利用同源重组原理获得了能在含卡那霉素的培养基上正常生长的基因敲除突变株。对该突变株基因组DNA进行PCR扩增,验证了其基因结构的正确性。     

禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析

基于禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌国内分离株A2(血清型O2:K89)Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株A2△fimH::Cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20(温度敏感性)以去除上述缺失突变株中抗性基因标志,结合PCR扩增和测序结果,证明fimH基因缺失株.A2△fimH的正确构建.通过fimH基因互补试验使A2△fimH缺失突变株恢复了与野生株具有相同的凝集活性.红细胞和酵母细胞凝集试验结果表明,野生株呈现良好的凝集效果,并能被0.5%甘露糖完全抑制,而A2△fimH缺失突变株未呈现任何凝集现象.体外生长试验结果表明,在同样的培养条件下,A2△fimH缺失突变株生长周期的各个阶段都要稍慢于野生株.禽致病性大肠杆菌国内分离株Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株成功构建,为进一步深入研究禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制,肠道外感染的致病机理及对国内禽大肠杆菌病的防控策略奠定了一定基础.     

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。