中国地方鸡种MHC B-LBⅡ新等位基因的遗传多态性研究

为研究鸡MHC B-LBⅡ基因的遗传多态性,首先在8个中国地方鸡种(藏鸡、仙居鸡、北京油鸡、固始鸡、斗鸡、丝羽乌骨鸡、白耳鸡和狼山鸡)B-LBⅡ基因第二外显子扩增了一长度为 175 bp 的 DNA 片段并进行 SSCP 基因型分析;在8 个地方鸡种共 467 个个体中检测到 37 个 PCR-SSCP 基因型;从被检样品中筛选出不同基因型的个体,并在其 B-LBⅡ基因组中扩增了一个包括其第二外显子和第二内含子在内长度为374 bp的片段,通过克隆和测序获得了该片段的核苷酸序列。经序列分析,在前述地方鸡种被筛选出的 30 个无血缘关系的个体中发现了 31 个 B-LBⅡ新等位基因,并参照哺乳动物 MHC II 类 B 等位基因命名规则进行了命名。对这 31 个 B-LBⅡ新等位基因长度为 374 bp 的 DNA 片段进行比对表明,在其第二外显子序列上共有 68 个多态性变异位点,其中简约性信息位点 51 个,单变异位点 17 个,具有丰富的遗传多态性。在这些多态性变异位点中,出现在遗传密码子第一和第二位上的碱基替换率分别为 36.76% 和 35.29%。等位基因序列间的相似性估测为 90.6%-99.5%;B-LBⅡ基因第二外显子的错义替换率和同义替换率分别为 14.64±2.67%和 2.92±0.94%。结果表明,B-LBⅡ基因的丰富遗传多态性主要是由基因重组和平衡选择效应所引起的。对 B-LBⅡ等位基因第二外显子所编码的 B-LBⅡ分子β1 结构域氨基酸序列比对发现,31 个 B-LBⅡ新等位基因属于 26 个等位基因主型;在β1结构域氨基酸序列的 33个变异位点上,存在 6 个同义替换和 27 个错义替换。分析认为,那些发生在多肽结合位点上的氨基酸错义替换与鸡 MHC B-LBⅡ分子的免疫特异性有关。该结果可为鸡的抗病育种研究提供分子生物学依据。     

中国部分地方鸡种MHC B-G基因第二外显子的遗传多态性

根据鸡主要组织相容性复合体BG基因序列设计特异性引物,在9个中国地方鸡种和1个国外引进鸡种基因组中扩增了包括其第一内含子和第二外显子在内、长度为401bp的DNA片段。经PCRSSCP分型筛选后,对该片段的核苷酸序列进行克隆测序和直接PCR测序及比对分析,发现了31个MHCBG新等位基因;各等位基因主型所含有的亚型数及其在不同品种间的分布极不均衡。第二外显子核苷酸序列和其所编码的MHCBG抗原类IgV结构域氨基酸序列比较表明,在中国地方鸡种BG基因第二外显子的207bp序列中有37个多态性变异位点,其中简约性信息位点29个,单个位点的变异8个;等位基因间的遗传变异范围0.0013-0.1433;各变异位点的核苷酸变异指数0.206-1.462。该编码区核苷酸的异义替换率为9.26%±1.92%,高于同义替换率2.34%±0.90%。所估计的核苷酸转换数和颠换数随着遗传距离的增加而逐渐增加,当核苷酸转换数和颠换数达到平衡后,该片段核苷酸转换数的增加幅度逐渐高于颠换数。在其所编码的类IgV结构域氨基酸序列中,多态变异位点有22个,其中简约性信息位点6个,单变异位点16个;所估测的等电点为8.45,疏水性氨基酸占40.3%,亲水性氨基酸占29.9%;该序列具有明显的疏水性特点。等位基因间的系统发生分析表明,31个BG等位基因分为两个群,相同主型的等位基因首先聚类。本研究为鸡BG基因的免疫功能和遗传进化研究提供了分子依据     

合作猪SLA-DQA基因外显子2多态性分析

旨在研究合作猪DQA基因外显子2多态性,确定其等位基因数、核苷酸多态位点、氨基酸多态位点及各个等位基因之间的遗传关系,分析其进化意义。选用PCR-SSCP对439只合作猪SLA-DQA基因外显子2的多态性进行检测;测序群体内因变异而产生的各等位基因序列,并分析序列数据。结果显示,在合作猪SLA-DQA外显子2中发现了7个新等位基因,共18个核苷酸多态位点,10个氨基酸多态位点。合作猪SLA-DQA外显子2具有较丰富的多态性,群体内可能蕴藏着更加丰富的遗传资源;合作猪SLA-DQA外显子2基因最初可能由一个等位基因突变分化成一大类基因;合作猪SLA-DQA外显子2序列与各个猪种的SLA-DQA外显子2序列具有较高的同源性,预示着这些猪种的SLA-DQA外显子2基因最早可能来源于其分歧之前的共同祖先原始序列;新发现的7个SLA-DQA外显子2等位基因,可能由遗传关系较近的两个等位基因突变产生。     

乌龟MHCⅡ类B基因第二外显子的克隆及序列分析

利用一对兼并性引物扩增了乌龟MHCⅡ类分子B基因第二外显子的部分片段,并对PCR产物进行了克隆和测序,结果得到8种长度为166 bp的不同序列。经分析,序列中有84个变异位点,核苷酸的非同义替换(dN)多于同义替换(dS),造成39个位点氨基酸的改变。氨基酸的替换趋于集中在假定的抗原结合位点附近。利用MEGA、PAUP软件分别构建NJ树和MP树,两种树极为相似,均分为两支。同一个体中出现有多种序列,提示乌龟MHCⅡ类分子B基因可能存在着座位重复。研究表明:乌龟MHCⅡ类分子B基因第二外显子有较高的多态性,有利于乌龟野生种群的遗传保护。     

日本牙鲆主要组织相容性复合体DAB等位基因的多态性

根据牙鲆(Paralichthys olivaceus)主要组织相容性复合体(MHC)DAB基因序列设计特异性引物,在日本牙鲆基因组中扩增了包括DAB基因完整外显子2和内含子1在内的长度为408 bp的DNA片段.对该片段克隆测序后,发现了37个MHC-DAB等位基因,各等位基因的频次以及各主型中亚型数目分布都不平衡.在第二外显子273 bp核苷酸序列中有50个位点发生变异,核苷酸多样性PI值为0.0618,在编码的氨基酸序列中存在多态变异位点30个,其中简约信息位点29个,单变异位点1个.非同义替代与同义替代的比率在抗原结合区(PBR)和非PBR编码区分别为10.0和1.62,分析表明正向选择机制可能是产生牙鲆MHC-DAB多态性的主要因素.估计的核苷酸的转换和颠换数随着遗传距离的增加而增加.各等位基因间的系统发生关系表明,19个主型分为两个群.对氨基酸组分和密码子的偏倚性以及分布频率的分析表明各同义密码子的使用频率不均衡.本研究为牙鲆MHC-DAB基因的遗传进化和分子标记辅助育种的研究提供了理论基础.     

扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元的克隆及序列分析

3头扬子鳄血样取自宣城安徽省扬子鳄繁殖研究中心。利用一对简并引物对MHCⅡ类B基因第二外元的部分片段进行扩增;通过克隆、单链构象多态性分析、测序,并将测得序列与下载的8个物种MHC序列比对,确定序列差异和变异位点;利用MEGA软件构建NJ树,PAUP4．0构建MP树。结果得到10种不同的序列,片段长166bp。核苷酸序列中有38个变异位点,氨基酸序列中有23个变异位点;推定的抗原结合位点非同义替换(dN)明显高于同义替换(dS)。10种序列的NJ树和MP树极为相似,均为A、B两个分支,两个分支明显的特异性位点核苷酸序列中有9个。氨基酸序列中有7个。表明扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元有较高的多态性,有利于扬子鳄饲养种群的遗传保护。     

尼罗鳄MHCⅡ类B基因第二外元的序列变异分析

利用一对简并引物扩增了尼罗鳄MHCⅡ类分子B基因第二外元的部分片段,并对PCR产物进行了克隆和测序,结果得到8种不同的序列,序列长度为166 bp;经分析,序列中有56个变异位点,核苷酸的非同义替换多于同义替换,造成30个位点氨基酸的改变,氨基酸的替换趋于集中在假定的抗原结合位点附近.核苷酸和氨基酸序列与已报道的扬子鳄和密河鳄的MHCⅡ类B基因第二外元序列有较高的同源性,利用PAUP4.0软件构建的NJ树显示,鳄类的MHCⅡ类B基因存在跨种多态性现象.     

牙鲆MHC-DAA结构及其等位基因多态性

为了探讨牙鲆MHC-DAA等位基因的多态性, 根据牙鲆 (Paralichthys olivaceus) MHC-DAA的cDNA序列设计特异引物, 扩增内含子序列。牙鲆DAA基因由4个外显子和3个内含子组成, 与大西洋鲑 (Salmo salar) DAA基因结构相同, 在内含子2中存在一个高度多态的微卫星位点(GT)n。根据获得的MHC-DAA基因组序列设计特异性引物, 在45尾牙鲆中扩增了包括完整外显子2和内含子2的长度约670 bp的DNA片段, 克隆测序后共发现30个MHC-DAA等位基因, 各等位基因的频次及其各主型中亚型的数目都不均衡。在249 bp的外显子2序列中共有55个位点发生变异, 核苷酸多样性指数为0.0887, 编码的氨基酸序列中多态变异位点31个, 其中简约信息位点30个, 单变异位点1个。非同义替代与同义替代的比率在PBR(Peptide binding region)和非PBR结合区分别为3.30和2.43, 分析证明平衡选择是牙鲆存在众多DAA等位基因的发生机制。     

兴国红鲤MHCⅡ类基因多态性、表达及其与鱼体抗病力关系的分析

对41尾感病和22尾抗病兴国红鲤的308个有效克隆进行测序,获得171条不同的MHC Ⅱ类基因编码序列,分属26个不同的等位基因,其中Cyca-DXA24Cyca-DXA36为新发现的13个等位基因。MHCⅡ类基因片段的长度为624 bp,包括第14个外显子,分别编码信号肽、1和2结构域及连接肽/跨膜区。1结构域的变异明显大于2结构域,表现在1结构域中核苷酸和氨基酸变异位点比例（55.16%和79.76%）明显高于2结构域的变异位点比例（45.96%和68.42%）。1结构域的PBR区的非同义碱基替换率（dN）与同义碱基替换率（dS）的比值 （=dN/dS）为5.742,远远高于非抗原结合位点（non-PBR）及2结构域的0.755、0.592,揭示兴国红鲤MHC Ⅱ类基因的1结构域在进化过程中受到正向选择作用。等位基因Cyca-DXA24 （P0.01）与兴国红鲤对嗜水气单胞菌的抗性相关,等位基因Cyca-DXA3 （P0.05）、Cyca-DXA4 （P0.01）、Cyca-DXA6 （P0.05）、Cyca-DXA33 （P0.05）与兴国红鲤对嗜水气单胞菌的易感性相关。荧光定量PCR结果表明,MHCⅡ类基因在健康兴国红鲤的肾、肝、鳃等10个组织均能普遍表达。人工感染嗜水气单胞菌后,肾、肝、脾3个组织中的MHCⅡ类基因的表达量均发生了不同程度的变化,表明MHCⅡ类分子在兴国红鲤的免疫反应中起到重要作用。       

河西绒山羊DRB3基因外显子2多态性分析

研究采用PCR-SSCP方法检测1 046只河西绒山羊DRB3基因第2外显子的多态性,并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因,分析各等位基因间的遗传关系和进化意义。结果表明,河西绒山羊DRB3基因第2外显子表现了18个等位基因(LG001-LG018)控制的31个基因型,LG005为优势等位基因,LG005*005为优势基因型,18个单倍型序列分析发现44个核苷酸多态位点、29个氨基酸多态位点;与GenBank下载序列比对分析结果表明,16个DRB3的等位基因是本研究首次发现;DRB3基因遗传多态指数中,观察杂合度为0.269 6,多态信息含量为0.869 9,有效等位基因数为1.369 1;经χ2适合性检验,该群体偏离了Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05);18个DRB3基因外显子2的单倍型序列NJ系统发育树呈2支分化趋势。研究认为河西绒山羊DRB3基因第2外显子具有丰富的遗传多态性;河西绒山羊DRB3基因最初由2个等位基因突变分化成两大类等位基因。     

三种猫科动物MHC Class Ⅱ DRB等位基因序列变异性分析

分析了云豹(Neofelisnebulosa)、豹(Pantherapardus)和东北虎(Pantheratigrisaltaica)等3种猫科动物的主要组织相容性复合物ClassⅡDRB座位的等位基因序列变异性。使用一对简并性引物扩增了DRB座位第二外元目标片段。用单链构像多态性分析方法确定不同的单倍型。每个个体挑出15个单克隆用来分离、纯化和测序。实验中从4个个体中获得了8种不同序列。237bp核苷酸序列中发现有59个变异位点。根据人类的抗原肽结合区推测79个氨基酸位点中存在21个假定的抗原肽结合位点,而且非同义替换率明显高于同义替换率,这可能说明了第二外元的较高变异性是由平衡选择作用来维持的。重建的NJ树和MP树显示豹和东北虎的亲缘关系较近,而两者与云豹的亲缘关系较远。     

兴国红鲤 MHC Ⅱ类 α 基因多态性、表达及其与鱼体抗病力关系的分析简

对41尾感病和22尾抗病兴国红鲤的308个有效克隆进行测序,获得171条不同的MHCⅡ类α基因编码序列,分属26个不同的等位基因,其中Cyca-DXA24—Cyca-DXA36为新发现的13个等位基因。MHCⅡ类α基因片段的长度为624 bp,包括第1—4个外显子,分别编码信号肽、α1和α2结构域及连接肽/跨膜区。α1结构域的变异明显大于α2结构域,表现在α1结构域中核苷酸和氨基酸变异位点比例(55.16%和79.76%)明显高于α2结构域的变异位点比例(45.96%和68.42%)。α1结构域的PBR区的非同义碱基替换率(dN)与同义碱基替换率(dS)的比值ω(ω=dN/dS)为5.742,远远高于非抗原结合位点(non-PBR)及α2结构域的0.755、0.592,揭示兴国红鲤MHCⅡ类α基因的α1结构域在进化过程中受到正向选择作用。等位基因Cyca-DXA24(P0.01)与兴国红鲤对嗜水气单胞菌的抗性相关,等位基因Cyca-DXA3(P0.05)、Cyca-DXA4(P0.01)、Cyca-DXA6(P0.05)、Cyca-DXA33(P0.05)与兴国红鲤对嗜水气单胞菌的易感性相关。荧光定量PCR结果表明,MHCⅡ类α基因在健康兴国红鲤的肾、肝、鳃等10个组织均能普遍表达。人工感染嗜水气单胞菌后,肾、肝、脾3个组织中的MHCⅡ类α基因的表达量均发生了不同程度的变化,表明MHCⅡ类α分子在兴国红鲤的免疫反应中起到重要作用。     

辽东湾斑海豹MHC-DQB 基因的遗传多样性分析

本文从25 份斑海豹样本中获得141 bp 片段,发现21 个变异位点,定义了12 个MHC-DQB 等位基因,氨基酸变异率为25.5% 。等位基因之间的遗传距离范围是0. 0071 ～ 0.1064,平均值为0.0577,不同等位基因之间的碱基差异是1 ～ 15 bp,平均差异数为8 bp。与其他鳍足类动物对比后发现,斑海豹MHC-DQB 表现出较丰富的多态性。非同义替换率明显高于同义替换率,由此造成的氨基酸替换集中在肽结合位点PBR 附近,表明DQB 基因受到强烈的平衡选择作用。11 个样本出现多于两条等位基因的情况,推测存在基因重复现象。     

中国部分猪种SLA-DQB外显子2遗传多样性

运用PCR-SSCP和克隆测序对中国部分猪种的SLA-DQB基因外显子2的多态性分析表明：有功能的DQB基因有68个新等位基因,假基因（SLA-DXB）等位基因有5个。各等位基因的数量分布极其不平衡,而且许多品种都表现出共享等位基因。9个主要等位基因中, C08广泛分布在中国猪种的6大地方类型11个品种及云南和四川野猪中,它为中国猪种特有的共享等位基因,占总数的55.10%。在单一的个体中拥有5条以上序列,说明SLA-DQB基因座在某些品种中拷贝数为3个。SLA-DQB外显子2的等位基因核苷酸和氨基酸多态变异位点分别高达81个和49个,等位基因多样度（H=0.889）以及核苷酸多样度（Pi =0.047）都很高,总体表现为β折叠区的Pi值均高于α螺旋区。综合分析表明华南型、西南型猪H和Pi均较高,高原型的藏猪最低。类群内遗传距离排序与Pi值高低排序一样,可见各地方类型中核苷酸替换的差异正比于核苷酸多样度。类群间遗传距离比较,江海型与华北型间的距离最大,而华中型和高原型间的遗传距离最小。     

白鱀豚MHC基因类DQB1座位第二外元的序列变异分析

测定了 4 5个克隆的白豚 (Lipotesvexillifer)MHCⅡ类基因DQB座位第二外元 172bp的核苷酸序列 ,共获得 15种序列 ,发现了 2 2个变异位点。核苷酸的非同义替换明显多于同义替换 ,并造成了 15个氨基酸的改变。氨基酸的替换趋于集中在假定的与抗原的选择性识别相关的位点附近。白豚DQB基因的核苷酸和氨基酸序列与文献报道的白鲸 (Delphinapterusleucas)和一角鲸 (Monodonmonoceros)DQB1序列具有较高的同源性。氨基酸序列不具备人及其它一些灵长类动物DQB2基因所共有的基序 (Motif) ,而与牛DQB1基因的基序相近 ,说明本研究得到的白豚MHC序列应属于类DQB1基因。同一个体出现了多种序列的情况 ,提示白豚的DQB基因可能存在着座位重复。白豚的类DQB1座位的序列中存在多种基序的不同组合 ,推测是由于基因转换造成的.     

白(既鱼)豚MHC基因类DQB1座位第二外元的序列变异分析

测定了45个克隆的白(既鱼)豚(Lipotes vexillifer)MHC Ⅱ类基因DQB座位第二外元172 bp的核苷酸序列,共获得15种序列,发现了22个变异位点.核苷酸的非同义替换明显多于同义替换,并造成了15个氨基酸的改变.氨基酸的替换趋于集中在假定的与抗原的选择性识别相关的位点附近.白(既鱼)豚DQB基因的核苷酸和氨基酸序列与文献报道的白鲸(Delphinapterus leucas)和一角鲸(Monodon monoceros)DQB1序列具有较高的同源性.氨基酸序列不具备人及其它一些灵长类动物DQB2基因所共有的基序(Motif),而与牛DQB1基因的基序相近,说明本研究得到的白(既鱼)豚MHC序列应属于类DQB1基因.同一个体出现了多种序列的情况,提示白(既鱼)豚的DQB基因可能存在着座位重复.白(既鱼)豚的类DQB1座位的序列中存在多种基序的不同组合,推测是由于基因转换造成的[动物学报 49(4):501～507,2003].     

猪MHC-Ⅱ类区DQA新等位基因及新突变位点的发现

根据猪SLA-DQA基因cDNA序列和人HLA-DQA基因组序列设计引物,在猪中成功扩增了一个731bD的片段,该片段包括猪SLA-DQA基因的大部分第2外显子、完整第2内含子和少部分第3外显子,通过克隆和PCR直接测序获得该片段的核苷酸序列。在家系中对第2外显子的核苷酸序列和其编码的α1结构域的氨基酸序列进行了分析,并与GenBank中所有的SLA-DQA第2外显子序列进行比较分析,发现有4个新突变位点和两个新等位基因存在。新等位基因分别是DQA—SLT26和DQA—TC 21—1。DQA—SLT26与单倍型c、d相比有8个核苷酸的差异和4个氨基酸的改变：单倍型c、d在60、65、81、93位的氨基酸分别是Val、Lys、Asp、Lys;而DQA—SLT 26相应的氨基酸是Ala、Glu、Gly、Ile。DQA—TC 21—1与单倍型c、d相比存在1个氨基酸的改变,由单倍型c和d中94位氨基酸His变为Tyr。     

3个鸡种GARS-AIRS-GART基因第21号外显子的SNPs检测

采用PCR-SSCP和DNA测序法对安卡鸡、文昌鸡和如皋鸡中GARS-AIRS-GART基因的第21号外显子进行SNPs检测.结果发现该外显子含4个核苷酸多态位点:G29943A、C29968T、T30011C和C30017T,其中3处为非同义突变,分别为:29 943处天冬氨酸(Asp)→天冬酰胺(Asn)、30 011处色氨酸(Trp)→精氨酸(Arg)、30 017处精氨酸(Arg)→半胱氨酸(Cys);另一处为同义突变.对多态位点进行单倍型分析,发现12种单倍型,其中两种单倍型(5号和6号)的频率超过10%,分别为0.330 0和0.162 8,1号、3号、9号和10号单倍型频率介于1%～10%之间,其余都小于1%.另外共检测到11种基因型,存在5种等位基因,安卡鸡的D和E等位基因的基因频率较高,基因型与其它两个鸡品种之间都存在着极显著的差异(P<0.01),表明我国地方鸡种和外来鸡种在遗传组成上存在着差异.本研究将为鸡肉品质相关研究积累基础数据,为今后深入开展肉品质的开发利用奠定理论基础.     

八眉猪SLA-DRA基因第4外显子多态性分析

[目的]研究八眉猪SLA-DRA基因第4外显子的多态性,确定其等位基因数以及核苷酸和氨基酸变异位点,探讨其遗传特性。[方法]采用PCR-SSCP和克隆测序的方法对八眉猪SLA-DRA基因第4外显子进行多态性检测。[结果]八眉猪SLA-DRA基因第4外显子共有3种等位基因(A、B、C),形成3种基因型(AA、BB、BC),其中B为优势等位基因,BC为优势基因型。序列对比结果表明,八眉猪SLA-DRA基因第4外显子共有3个核苷酸突变位点(c.4167AG、c.4246AG和c.4282CT),其中4 167 bp的突变导致谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)。群体遗传学分析表明,八眉猪SLA-DRA基因第4外显子的多态信息含量为0.3953,杂合度为0.7241,且八眉猪在SLA-DRA基因第4外显子上偏离了Hardy-Weinberg平衡(p0.01)。[结论]八眉猪SLA-DRA基因的第4外显子属于中度多态,并呈现出杂合子优势。     

3个不同尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)群体MHC ⅡA基因多态性和遗传分化

MHC ⅡA作为主要组织相容性复合体的重要成分之一,在鱼类的免疫系统中发挥重要作用,具有高度多态性。本研究从广东省3个不同养殖地区的91尾尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的个体中获得了MHC ⅡA的第二外显子区域序列共501条,长度为647～742 bp。对该序列进行分析,共发现12个不同的等位基因。三个群体中核苷酸序列变异百分比为34.73%～60.78%,氨基酸变异百分比为68.24%～78.82%,其中惠州群体的变异比例最高(60.78%和78.82%)。单倍型多样性和核苷酸多样性分析表明:惠州群体的遗传多样性最为丰富。群体间分化指数(Fst)、中性检测(Tajima检测)、平均基因流、平均K2-P遗传距离和AMOVA分析的各项数据表明MHC ⅡA基因的第二外显子区域在3个不同群体间遗传分化不显著,存在一定的基因交流。本研究发现的MHC ⅡA基因的高度多态性及遗传结果,为尼罗罗非鱼抗病品种的选育以及种质资源的保护奠定了重要的基础资料。