暗纹东方鲀耐寒相关基因CIRBP、HMGB1和AFP-Ⅳ的分子特征和对低温胁迫的响应

为了探索暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)对低温环境的响应机制,克隆了暗纹东方鲀耐寒相关基因CIRBP、HMGB1和AFP-Ⅳ的cDNA序列,并进行了基因的分子特征和功能分析。组织分布检测显示CIRBP和HMGB1在下丘脑、肝脏和肌肉中具有高表达,而AFP-Ⅳ则主要在肝脏中表达。在受到低温胁迫后, 3种基因在肝脏和下丘脑中的表达呈现不同的变化趋势,其中CIRBP基因在肝脏中于48h表达量显著增加,在下丘脑中于12h和48h有上调表达; HMGB1基因在肝脏中呈现逐渐上升的趋势,于48h达到最大值,而在下丘脑中呈现先上升后下降的趋势,处理后2h达到最大, 2—8h下降,于8h下降至最低,随后恢复至初始水平;肝脏中的AFP-Ⅳ在0—24h无显著变化,在48h上升至最大值。进一步通过大肠杆菌原核表达系统研究了AFP-Ⅳ的抗冻功能,发现AFP-Ⅳ融合蛋白在–80℃下具有抗冻活性,并且抗冻活性随着浓度的增加而提高。研究结果表明3种基因都参与了暗纹东方鲀对低温胁迫的应答过程,为深入探索暗纹东方鲀的耐低温机制奠定了基础。     

中华鳖5个群体遗传多样性的微卫星分析

利用微卫星分子标记技术对洞庭(DT)、黄河(HH)、黄沙(HS)、日本(RB)以及洞庭(DT)与黄河(HH)的杂交子代(DT♀×HH♂)绿卡(LK)5个中华鳖群体的150个个体进行遗传多样性分析。11对微卫星引物扩增出的等位基因数为3～6个,平均等位基因数为4.1818。5个种群相比,绿卡(LK)的平均有效等位基因数、平均期望杂合度、平均观测杂合度和平均多态信息含量最高,分别是2.3969、0.5274、0.5545和0.4660。对种群间的遗传分化分析表明,黄河(HH)和洞庭(DT)之间的遗传分化最小,为0.0233,而洞庭(DT)和日本(RB)之间的遗传分化最大,为0.0969。基于Nei’s遗传距离构建的UPGMA系统进化树显示黄河(HH)和洞庭(DT)及其子代绿卡(LK)亲缘关系较近,而与黄沙(HS)和日本(RB)的亲缘关系较远,最远的为日本(RB)群体。     

基于微卫星的中华鳖(Pelodiscus sinensis)选育世代遗传多样性监测

本研究利用微卫星技术,对选育的中华鳖F3、F4、F5代群体的遗传多样性进行了监测,并与日本鳖群体进行了比较。结果显示,在筛选的15个微卫星位点中,4个群体共218个个体共检测到等位基因数138个,平均等位基因数(Na)为7.2~8.4,平均观测杂合度(Ho)为0.512 3~0.626 5,平均期望杂合度(He)为0.574 9~0.646 1,平均多态信息含量(PIC)为0.534 6~0.604 9,表明这些中华鳖群体有较丰富的遗传多样性。中华鳖选育群体F3、F4、F5代及日本鳖群体的遗传多样性参数Na分别为8.400、7.733、7.200、7.200,Ho分别为0.626 5、0.527 4、0.478 7、0.512,He分别为0.646 1、0.639 8、0.642 0、0.574 9,PIC分别为0.604 9、0.598 2、0.594 9、0.534 6,显示中华鳖群体随着选育进程,遗传多样性逐渐下降,但仍然比日本鳖群体高,还可以进行进一步的选育。中华鳖选育群体在聚类分析中聚为一支,而日本鳖群体单独聚为一支,这说明人工选育对生物进化与地理分化的历史局面没有产生影响。     

黄喉拟水龟转铁蛋白重组表达及抗菌活性分析

转铁蛋白具有多种生物学功能,不仅参与铁的转运,而且具有抗菌、免疫调节等功能。对黄喉拟水龟转铁蛋白(Mauremys mutica transferrin,MaTf)原核表达、重组蛋白纯化、抗菌活性检测及MaTf在蛋白水平的表达特征进行了分析研究。通过用RT-PCR技术扩增MaTf的编码序列,克隆至载体pET-32 a(+);转化BL21(DE3),构建了其原核表达载体;优化表达条件(30℃,4h,0.8 mmol/L IPTG),使MaTf融合蛋白在BL21中高效表达;采用His Bind柱亲和层析与浓缩的方法纯化目的蛋白,Western blot证实获得纯度较高的MaTf重组蛋白;抑菌试验表明,MaTf重组蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和黏质沙雷氏菌均有明显的抑菌作用;用MaTf重组蛋白制备多克隆抗血清,Western blot免疫印记法分析转铁蛋白在体内的表达特征,结果显示其在肝脏、脾脏、肾脏、心脏4个组织中的表达量为:肝脏>脾脏>肾脏>心脏,与MaTf在RNA水平上的表达特征具有相似性。研究为探索转铁蛋白在黄喉拟水龟非特异性免疫反应中的作用提供了重要信息。     

鲫鱼干扰素调节因子1功能初步研究

将鲫鱼IRF1基因的ORF与真核表达质粒pcDNA3．1（＋）相连,构建了真核重组表达载体,转染并通过G418筛选获得了稳定转染IRF1基因的细胞株。同时利用原核表达系统成功获得了包含鲫鱼IRF1C端165个氨基酸的多肽,制备了抗鲫鱼IRF1的多克隆抗体。进一步从RNA和蛋白水平证明,在稳定转染IRF1基因的细胞株中IRF1能够组成型的过量表达,并且IRF1的过量表达伴随IFN基因的表达水平增强。同时PolyI：C的诱导能使稳定表达IRF1的细胞中干扰素系统基因STAT1和IF158的表达显著增强。研究结果表明,过量表达IRF1能调控鲫鱼IFN以及ISG基因的表达。     

主要组织相容性复合体(MHC)基因的研究概况

主要组织相容性复合体(MHC)因其在免疫方面的重要作用而倍受免疫学家重视．随着研究的不断深入,了解到MHC是一个高度多态的基因群,它广泛分布于各种脊椎动物体内．MHC除了具有免疫功能外,还在其它许多方面起作用．MHC基因的多态性是最受关注的特征,尤其是Ⅱ类基因．根据MHC基因的多态性,可以在遗传、进化、行为、保护及生态等许多方面对其进行研究．就目前的研究情况,在结构、功能及应用等方面对MHC作了介绍．     

温度对中华鳖血浆皮质酮水平、免疫生化指标及抑菌效果的影响

对正常生长状态下3种月龄(12、18、24月龄)的中华鳖血浆皮质酮(corticosterone,CORT)进行了测定,并以(28±2)℃为恒温对照组,研究变温(10、20、33℃)对同一年龄段中华鳖血浆CORT水平、免疫生化指标以及抑菌效果的影响。结果表明:12月龄与24月龄个体间血浆CORT水平有显著性差异(P0.05);各温度处理组中华鳖血浆CORT含量随时间呈先升后降的变化趋势,其中10℃和20℃组的CORT水平在4和6 h时与对照组有显著性差异(P0.05);各温度处理组酶活性和蛋白含量随时间的增加先升后降,但与对照组无显著性差异(P0.05);血浆抑菌效果与血浆CORT水平呈负相关。实验表明,温度骤变会促使中华鳖产生应激反应,并使机体血浆内的CORT水平增加,免疫生化发生改变,抑菌效果下降,从而降低机体的免疫力。     

扬子鳄鞣制皮革和鳞片的DNA提取方法

运用一种改进的提取方法 ,作者从鞣制皮革中成功地提取了总DNA ,同时还对尾尖皮、鳞片、盐腌生皮等皮质进行了DNA提取 ;用 12SrRNA基因扩增的通用引物、扬子鳄鉴别引物、微卫星引物及RAPD引物进行PCR扩增 ,并对部分扩增结果进行测序 ,以检验提取效果。结果证明 ,几种皮质标本都可提取出DNA ,其中尾尖皮和鳞片的提取效果较好 ,用四种引物都可扩增出明显亮带 ;盐腌生皮和鞣制皮提取结果也很好 ,并且用12SrRNA通用引物、扬子鳄鉴别引物扩增的亮带较明显 ,可进行扬子鳄皮质用品等的分子鉴定及部分序列的扩增和测序研究     

扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元的克隆及序列分析

3头扬子鳄血样取自宣城安徽省扬子鳄繁殖研究中心。利用一对简并引物对MHCⅡ类B基因第二外元的部分片段进行扩增;通过克隆、单链构象多态性分析、测序,并将测得序列与下载的8个物种MHC序列比对,确定序列差异和变异位点;利用MEGA软件构建NJ树,PAUP4．0构建MP树。结果得到10种不同的序列,片段长166bp。核苷酸序列中有38个变异位点,氨基酸序列中有23个变异位点;推定的抗原结合位点非同义替换(dN)明显高于同义替换(dS)。10种序列的NJ树和MP树极为相似,均为A、B两个分支,两个分支明显的特异性位点核苷酸序列中有9个。氨基酸序列中有7个。表明扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元有较高的多态性,有利于扬子鳄饲养种群的遗传保护。