平颏海蛇碱性磷脂酶A_2的融合表达、纯化及活性特征

 将编码平颏海蛇碱性磷脂酶A2 的基因 (PLA2 9)克隆于硫氧还蛋白基因融合表达载体pPETTRX的trxA基因的 3′末端 ,构建符合读码框的融合基因 .2 5℃下经IPTG诱导 ,该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达 ,表达量达 2 0 %以上 .利用金属螯合亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化 ,得到纯度 85%的融合蛋白 .经肠激酶切割和离子交换柱层析进一步纯化后 ,得到浓度 95%以上的成熟PLA2 9.对重组PLA2 9进行了Western印迹检测 .重组PLA2 9具有与天然PLA2 相近的酶活性 ;并具有对HL60等几种肿瘤细胞的细胞毒作用 ,这在海蛇PLA2 中是首次报道 .平颏海蛇碱性PLA2 融合表达及快速纯化系统的建立 ,为深入开展其结构与功能关系研究奠定了基础     

平颏海蛇PLA2在大肠杆菌中的融合表达

将编码平颏海蛇磷脂酶A2的基因(PLA29)分别克隆于硫氧环蛋白基因融合表达载体pThioHisC和pTRX的HP\|trxA和trxA基因的3′末端,构建符合读码框的融合表达载体pThioHisC\|PLA2和pTRX\|PLA2。25℃下经IPTG诱导,PLA2融合蛋白在两种原核系统中均能获得较高表达,但PLA2在pTRX系统下的表达量和蛋白溶解性优于pThioHisC系统。将两种系统下的表达产物进行金属螯合亲和层析纯化,Trx\|PLA2融合蛋白的纯度可达85%以上,而HPTrxPLA2不表现出对介质的亲和性,难以得到纯化。由此,将pTRX\|PLA2载体系统确立为进一步大量表达和纯化的载体系统。     

青环海蛇蛇毒组份中的胰蛋白酶抑制剂

青环海蛇属海蛇科,在我国南海与东海很常见。它的毒液有很强的毒性,其中含有神经毒素及多种蛋白质(Liuet al.,1973,1974;苏拔贤,曾家荣等,1984)。 已知蝰蛇科与眼镜蛇科蛇毒中含有蛋白酶抑制剂(Sadaaki Iwanaga et al.,1975与Yasuji Hokama et al,1976)。但尚未见关于海蛇科蛇毒中有胰蛋白酶抑制剂的实验报道。我们的工作中,初步发现海蛇科的青环海蛇蛇毒及其组份表现胰蛋白酶抑制剂活性。     

平颏海蛇3种短链神经毒素的基因克隆与功能比较

通过构建平颏海蛇毒腺cDNA文库得到 3个编码短链神经毒素的cDNA ,sn12、sn36和sn16 0 ,它们编码6 0个氨基酸的成熟肽 ,氨基酸序列比较表明三者之间只存在第 46位氨基酸残基的差异 ,分别为Pro4 6、His4 6和Arg4 6。在大肠杆菌中重组表达以上 3种同源序列 ,重组神经毒素SN12、SN36和SN16 0对昆明小鼠 (i.p .)的半致死剂量 (LD50 )分别是 0 .0 95 6mg/kg、0 .346 7mg/kg和 0 .2 192mg/kg ;在对昆明小鼠 (i.p .)的醋酸扭体反应镇痛实验中 ,SN12和SN16 0表现出相似的效果 ,而SN36则存在明显的差异。平颏海蛇短链神经毒素SN12、SN36和SN16 0之间只存在第 46位氨基酸残基的差异 ,在生物活性上却显示出明显的区别 ,因而推测第 46位氨基酸与短链神经毒素对烟碱型乙酰胆碱受体结合功能相关     

平颏海蛇毒的毒理学研究

用CM-sephadex C-50柱层析,醋酸铵缓冲液洗脱,从平颏海蛇(Lapemis hardwickii)毒腺提取物中分得15个蛋白组分。其中2个有磷脂酶A_2活性,用免疫学方法证实为肌肉毒组分。其中10个是能作用于突触后膜的神经毒组分。肌肉毒的蛋白质含量约占粗毒蛋白质总量的32.2％。神经毒的蛋白质含量约占粗毒蛋白质总量的52.3％。神经毒的毒性比肌肉毒的毒性强。这些结果提示,平颏海蛇毒有肌肉毒和神经毒两种。神经毒是平颏海蛇毒的主要毒性成分。     

α-银环蛇毒素同工毒素基因的克隆和表达

α-银环蛇毒素是存在于银环蛇蛇毒中的一种长链神经毒素,能与神经递质受体特异性结合,因此它不仅是神经信号传导机制研究的重要分子探针,更具有开发治疗某些神经性疾病新型药物的可能性。用SMART技术,反转录合成银环蛇毒腺cDNA,克隆并测定了α-银环蛇毒素基因,得到14种mRNA序列;进而将其中一种新的α-银环蛇毒素基因亚克隆到原核表达载体pQE30a和pGEX-4T-1中,在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达,其中带有GST融合蛋白的重组质粒α-BgTX(P22-A31)／pGEX-4T-1在BL21菌株中得到高效表达,表达量占菌总蛋白的30％,可溶形式存在的融合蛋白大于25％。     

CTLA4Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达

CTLA4Ig是人CTLA4胞外区与人免疫球蛋白铰链区、CH2区、CH3区组成的融合蛋白,可以与B7结合,通过阻断B7与CD28的结合,从而阻断B7介导的T细胞活化必需的共刺激信号,可作为免疫抑制剂用于器官移植。将CTLA4Ig融合分子克隆到真核表达载体pCI-dhfr,并用脂质体方法转染到COS7和CHO-dhfr-细胞中,用氨甲喋呤筛选转染的CHO-dhfr-细胞。用RT-PCR、ELISA、细胞免疫荧光染色和Western-blot鉴定重组蛋白的表达。采用A蛋白纯化重组蛋白。     

线粒体锚定对凋亡诱导因子抗氧化应激功能的影响

目的:构建带线粒体锚定信号肽的凋亡诱导因子(AIF)融合表达载体,研究在A549细胞中AIF线粒体锚定与其抗氧化应激功能的关系。方法:利用PCR将AIF原有线粒体定位信号(1-120 aa)替换成具有锚定功能的细胞色素c氧化酶Ⅳ亚型(COXⅣ)线粒体定位信号,并将COX-AIF克隆至pEGFP-N1和pDsRed1-N1载体,构建COX-AIF-GFP和COX-AIF-RFP融合表达载体;利用免疫印迹和激光共聚焦技术检测COX-AIF-GFP和COX-AIF-RFP的表达及其与线粒体的共定位;利用DCF染色和流式细胞技术检测A549细胞内过氧化物的水平。结果:表达了COX-AIF-GFP和COX-AIF-RFP融合蛋白,COX-AIF-GFP/RFP及AIF-RFP/RFP均定位于线粒体;与野生型AIF-RFP相比,COX-AIF-RFP可显著提高A549细胞的抗氧化应激能力。结论:AIF抗氧化应激能力依赖其在线粒体内膜的锚定。     

海蛇乙醇浸出物对小鼠抗疲劳作用的实验研究

目的　以小鼠为实验对象 ,研究海蛇乙醇浸出物 ( AEBFSS)的抗疲劳作用。　方法　每天灌胃给予小鼠 1次海蛇乙醇浸出物 ( AEBFSS) ,2 8天后测定小鼠的运动耐力 ,30天后测定小鼠的血清乳酸脱氢酶活力和肌糖原及肝糖原的含量。　结果　当海蛇乙醇浸出物 ( AEBFSS)灌胃剂量达到浸出蛋白5.0 mg/kg,与正常对照组比较 ,实验组的运动耐力和血清乳酸脱氢酶活力显著增强 ( P <0 .0 1) ,肌糖原和肝糖原的贮备量大大增加 ( P <0 .0 1)。　结论　海蛇乙醇浸出物 ( AEBFSS)具有明显增强小鼠运动耐力和延缓疲劳的作用     

肾上腺素能神经不参与由电场刺激所诱发的豚鼠回肠纵肌的抑制效应

本实验在离体的豚鼠回肠肌间神经丛一纵肌上进行。实验表明,10Hz 电场刺激产生的抑制效应与刺激时间相关非常显著。此抑制效应可被阿片受体阻断剂纳洛酮拮抗。α-肾上腺素能受体阻断剂酚妥拉明,β-肾上腺素能受体阻断剂心得安及去甲肾上腺素的膜摄取抑制剂可卡因均不能显著地改变此抑制效应。化学切割剂6-羟多巴胺损毁纵肌标本内肾上腺素能神经末梢后,该抑制效应无明显变化,且仍可被纳洛酮所拮抗。这些结果说明,肾上腺素能神经可能不参与由10Hz 电场刺激所诱发的抑制效应。     

弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白的融合表达和纯化

目的：原核表达重组弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为其功能研究奠定基础。方法：用PCR方法从弗氏2a志贺氏菌2457T株染色体中扩增YciD蛋白编码序列,经过纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,构建重组载体pET32a-yciD,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得工程菌株,对其表达和纯化条件进行优化;利用Western Blot检测融合蛋白的表达。结果：构建了YciD蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;经Ni-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的YciD蛋白;Western Blot表明,此蛋白可与His标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化弗氏2a志贺氏菌2457T株YciD蛋白,为进一步对其进行功能研究奠定了基础。     

人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

MMP-9-PEX原核表达、纯化及其对结肠癌细胞侵袭能力的影响

用RT-PCR法扩增出基质金属蛋白酶-9(MMP-9)C末端血红素结合蛋白样结构域(PEX),克隆至表达载体pET32a中并转化至E.coilBL21(DE3),经IPTG诱导后在约为42kDa处发现有外源基因的表达,密度扫描显示表达蛋白含量占菌体总蛋白的50%左右。重组蛋白质pET32a/PEX主要以包涵体形式表达,其在上清液中的含量极微。含8mol/L尿素和10mmol/LDTT的裂解缓冲液溶解的包涵体采用金属整合层析有效分离出目标蛋白,纯化后pET32a/PEX蛋白质的纯度大于90%。在Transwell实验中发现复性纯化后的重组蛋白质pET32a/PEX能抑制结肠癌细胞的侵袭,且呈剂量依赖性。     

抗菌肽CP10A在大肠杆菌中的融合表达

CP10A是一种由抗菌肽Indolicine经过序列改造,且对多数革兰氏阳性病源细菌具有较强抗菌活性的多肽序列。本研究根据已报道的CP10A氨基酸序列,兼顾大肠杆菌密码子偏好性,设计CP10A的核苷酸序列,利用PCR技术合成相应的DNA序列,后克隆构建重组表达载体pET32a（+）-CP10A,转入大肠杆菌AD494菌株。经IPTG诱导表达和15% SDS-PAGE电泳检测后发现产物以包涵体形式存在,且融合表达量占总蛋白的50%。在变性条件下经Ni-NTA亲合柱层析及复性,最终获得了较高纯度的可溶性重组蛋白。本研究首次实现了CP10A抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达,为进一步研究其生物学活性及应用奠定了一定的基础,同时也为研究抗菌肽表达提供了一种方法。     

片球菌素pediocin PA-1基因在大肠埃希菌中的融合表达

目的构建编码细菌素pediocin PA-1基因片段的原核表达载体,诱导表达,鉴定表达产物。方法重组DNA技术构建原核表达载体pET32-papA,IPTG诱导表达,用金属亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE与Westernblot对表达的重组蛋白进行鉴定。结果双酶切和测序鉴定显示papA片段插入正确,诱导表达后获得分子量为19 kD的融合蛋白,表达量为25%,用金属亲和层析的方法获得纯化的片球菌素pediocin PA-1。结论papA基因片段编码的蛋白质能在原核细胞中正确表达,为下一步研究该功能域的生物活性奠定了基础。     

重组土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA的融合表达及抗原性分析

目的:探索一种大量表达功能性土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA的方法。方法:采用SignalP 3.0 Server进行信号肽预测,将土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA信号肽的基因序列(75bp)去除,将1107bp的核心序列克隆至原核表达载体pET32a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。结果:构建了pET32a-fopA载体,重组蛋白FopA表达量约占菌体总蛋白量60%,Western blot分析显示重组FopA蛋白有较好的抗原性。结论:获得了高效表达FopA的pET32a-fopA表达载体,为下一步土拉弗朗西斯菌外膜蛋白FopA应用研究奠定了基础。     

立氏立克次体外膜蛋白H 基因片段的克隆表达与免疫原性分析

目的:克隆表达立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)外膜蛋白H基因(ompH)片段并对其进行免疫原性分析。方法:采用PCR技术从立氏立克次体基因组中扩增ompH基因片段,将该基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组原核表达质粒pET32a/ompH;将pET32a/ompH转入大肠杆菌细胞内,用IPTG诱导转化大肠杆菌表达目的基因。结果:获得长为327bp的ompH基因片段,SDS-PAGE分析发现pET32a/ompH转化菌表达了大小约27kDa蛋白,该蛋白与立氏立克次体免疫豚鼠血清及斑点热患者血清在免疫印迹分析中呈阳性反应,经该重组蛋白免疫血清中和后的立氏立克次体感染VERO活力减低。结论:pET32a/ompH转化的大肠杆菌表达了ompH基因片段,所产生的重组蛋白具有良好的免疫反应性及保护性。     

信号肽对短杆菌胆固醇氧化酶基因在大肠杆菌中表达的影响

从Brevibacterium sp．DGCDC-82染色体DNA中扩增出含信号肽序列的胆固醇氧化酶结构基因,插入大肠杆菌表达载体pET28a（＋）中,构建重组质粒pET28a—COD（s＋）。以pET28a-COD（s＋）为底物,扩增出不含信号肽的胆固醇氧化酶结构基因,构建成重组质粒pET28a-COD（s-）。两种重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）通过IPTG诱导均获得活性表达,SDS-PAGE分析,目的产物表达量都占到了细胞总蛋白的50％以上,Brevibacterium sp．DCR2DC-82胆固醇氧化酶的信号肽对重组酶的空间构象和表达量并没有太大的影响。     

重组人FOXL2基因的原核表达和纯化研究

目的通过pET32a（＋）原核表达载体,表达重组人叉头框蛋白L2（human forkhead box12,FOXL21）。并且进行纯化和鉴定。方法从正常人血液中提取基因组DNA,利用PCR扩增FOXL21目的基因片段,构建FOXL21原核表达重组质粒[pET32a（＋）-FOXL21]并转化E．coli的BL21（DE3）菌株,IPTG诱导重组蛋白表达,经HisTrap FF亲和层析柱纯化,再通过SDS—PAGE和Western印迹鉴定。结果成功克隆到大小为1131bp的人源FOXL21基因片段并准确插入表达载体pET32a（＋）,0．1mmol／LIPTG诱导转化菌8h可表达大量的FOXL21蛋白,并可经HisTrap FF柱亲和层析得到高度纯化。结论成功获得纯化的66kD重组人FOXL21蛋白,为后续进行FOXL21蛋白的功能研究奠定了基础。