抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。     

高亲和力抗有机磷杀虫剂单克隆抗体的制备与鉴定

制备抗有机磷杀虫剂单克隆抗体。采用人工合成带有特殊功能基团的半抗原,将其与载体蛋白偶联,以半抗原偶联物为免疫原,免疫BALBc小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,HAT选择、有限稀释法克隆化,建立分泌抗机磷杀虫剂单克隆抗体的杂交瘤细胞系。ELISA间接法和ELISA竞争抑制法检测抗体滴度,非竞争抑制法检测抗体亲和常数。结果获得9株分泌抗机磷杀虫剂单克隆抗体的杂交瘤细胞系,其中7株为型特异性,2株为组特异性;Ig亚型均为IgG1;亲和常数为407×108±043M和127×109±024M。结论为人工人工合成的、含特殊功能基团的半抗原,与载体蛋白偶联后,做免疫原,可用于制备高滴度的抗有机磷杀虫剂单克隆抗体,这种单抗可用于机磷杀虫剂残留物的免疫化学检测 。     

人突触小体相关蛋白25单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗人突触小体相关蛋白25(SNAP25)的鼠源单克隆抗体。方法:利用大肠杆菌表达SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠制备杂交瘤细胞,筛选针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,鉴定抗体亚型;用杂交瘤细胞株制备腹水单抗,纯化后利用SDS-PAGE检测抗体纯度。结果:表达并纯化得到纯度大于90%的SNAP25蛋白,免疫小鼠后经2轮筛选得到12株阳性杂交瘤细胞株,其中抗体重链包括IgG1、IgG2型,轻链大部分为κ链;选择具有相对较高抗原结合活性的14号杂交瘤细胞株制备腹水,纯化后得到纯度大于90%的抗体。结论:获得1株高纯度的针对SNAP25的鼠源单克隆抗体,为肉毒毒素的检测奠定了基础。     

肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)单克隆抗体制备及检测方法的建立

该文通过制备出特异性高的单克隆抗体,初步建立了双抗夹心ELISA定量测定CK-MB的方法,为CK-MB试剂和原料的国产化奠定重要的基础。以购入的CK-MB抗原为免疫原,对随机选取的5只6～8周龄Balb/c健康雌性小鼠进行免疫。采用有限稀释法、间接ELISA、捕获ELISA方法,最终筛选出了3株能够稳定分泌抗体的细胞株,分别命名为2F6、2H3和2H9,其分泌的单克隆抗体亚型均为IgG3,腹水效价分别为1:102000、1:51200和1:102000。采用亲和层析法对3株杂交瘤细胞产生的小鼠腹水进行纯化,分光光度计测定纯化后的单克隆抗体2H3、2F6、2H9的浓度分别为5 mg/mL、6 mg/mL、6 mg/mL, SDS-PAGE结果表明,成功纯化了小鼠腹水,能够清晰地观察到轻链和重链两条带。Western blot结果表明,单克隆抗体2F6、2H3和2H9均能特异性识别CK-MB蛋白。间接ELISA及捕获ELISA方法检测显示,单克隆抗体2H3只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2H9只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2F6只与CK-MB及CK-MM发生捕获ELISA方法反应。稳定性实验表明, 3株杂交瘤细胞都能稳定分泌抗CK-MB单克隆抗体。高质量单克隆抗体的获得,为建立CK-MB检测方法奠定了基础。     

F型肉毒毒素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备F型肉毒毒素(BoNT/F)鼠源单克隆抗体。方法:以BoNT/F重链C端(BoNT/FHc)为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后尾血效价最高小鼠的脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞Sp2/0在聚乙二醇作用下进行细胞融合,ELISA筛选阳性细胞孔,通过有限稀释法分离能稳定分泌抗体的细胞株。小鼠腹腔注射杂交瘤细胞制备的腹水利用Protein G进行亲合层析纯化,SDS-PAGE检测抗体纯度,非竞争ELISA测定抗体亲和力常数,亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型,PCR扩增抗体轻重链可变区基因并经Vbase软件分析抗体框架区与互补决定区(CDR)氨基酸序列。结果:经过3轮免疫后,5只小鼠尾血效价均达到1∶16 000,其中2号鼠尾血效价最高;杂交瘤细胞融合率为74.48%,阳性率为11.54%;2轮克隆化后筛选得到7株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,选择其中细胞培养上清效价最高的1F4制备抗体;腹水纯化后1F4抗体纯度超过95%,与BoNT/FHc抗原的亲和力常数为1.08×10-8mol/L;亚型鉴定结果表明1F4重链和轻链分别为IgG1型和κ型,抗体可变区氨基酸序列分析显示1F4重链和轻链CDR3序列为TRHGYFPSWFAY和QQHYSTPWT。结论:筛选到一株高亲和力的鼠源单克隆抗体,为BoNT/F检测和中和抗体的研发奠定了基础。     

番茄环斑病毒单克隆抗体的制备

以纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)为抗原,注射免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,经多次细胞筛选及克隆化,获得3株(A8、B7和G9)可分泌抗ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以之分别制备小鼠腹水单克隆抗体。经酶联免疫吸附试验检测表明,该3株杂交瘤细胞腹水抗体效价在10-5～10-6之间,且均具有与ToRSV反应的特异性。     

抗新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10单克隆抗体的制备及鉴定

目的:以新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10为靶抗原,制备并鉴定特异性抗CAP10的单克隆抗体。方法:用纯化的重组CAP10免疫BALB/c小鼠,血清抗体效价达到适当水平时进行细胞融合;经多次亚克隆筛选出分泌特异性抗体的细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定。结果:获得11株能稳定分泌抗新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10的单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗体效价高且抗原特异性强。结论:获得了针对新型隐球菌荚膜相关蛋白CAP10的单克隆抗体,为深入研究CAP10蛋白的功能,以及临床新型隐球菌的检测和血清型分析奠定了基础。     

抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的制备

目的:制备分泌特异性抗人甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为建立高灵敏度的Tg检测方法做准备。方法:以天然人源甲状腺球蛋白为抗原经皮下免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合制备分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体,并对其进行特异性鉴定,建立检测Tg的双抗体ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)夹心法。结果:获得7株可稳定分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经ELISA鉴定,筛选抗体可与Tg抗原有良好的特异性反应。建立的双抗体夹心ELISA方法敏感性可达1 ng/mL。结论:成功制备了抗人Tg单克隆抗体并建立了检测人Tg双抗体夹心ELISA方法,为进一步研发Tg快速诊断试剂盒提供了原料。     

活化相关分泌蛋白1单克隆抗体的制备及其在保守结构域鉴定中的应用

目的:制备重组活化相关分泌蛋白1(ASP-1)的单克隆抗体,并用其鉴定保守结构域。方法:用原核表达并纯化的重组ASP-1不加佐剂免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术及有限稀释传代法筛选稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水后用间接ELISA进行抗体特异性鉴定和效价检测,利用肽结合ELISA和Western印迹鉴定单抗识别的保守结构域。结果:获得5株能稳定分泌抗ASP-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,且5株单抗的识别区域均为21~28氨基酸残基的保守性结构域。结论:制备了抗ASP-1的单克隆抗体,为深入研究ASP-1佐剂的活性功能区及作用机制提供了有效工具。     

群特异性蓝舌病病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备群特异性抗蓝舌病病毒（BTV）单克隆抗体,并对其特性进行鉴定,为建立检测BTV抗原及抗体的ELISA方法奠定基础。方法：用纯化的BTV颗粒为免疫抗原免疫BALB/c鼠,以大肠杆菌表达的VP7蛋白作为筛选抗原,用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株;选取抗体效价最高的一株制备BTV单克隆抗体,以该抗体为捕获抗体与8种不同血清型BTV进行ELISA反应,结果与细胞病变反应进行比对;以该抗体为竞争抗体,与12种不同血清型绵羊BTV抗血清进行竞争ELISA反应,并将结果与参比c-ELISA试剂盒结果进行比对。结果：筛选出5株稳定分泌BTV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并选其中一株（3E2）制备了高纯度的单克隆抗体;该单抗用于检测不同血清型BTV,与细胞病变反应结果完全相符;用于检测不同血清型绵羊BTV抗血清,其结果与参比c-ELISA试剂盒符合率为100%,与鹿流行性出血热病毒抗原和抗体均无交叉反应。结论：制备的BTV单克隆抗体具有良好的群特异性,可用于检测不同血清型BTV抗原及BTV抗体。     

人生长分化因子15单克隆抗体制备、鉴定及药用价值初探

目的:制备稳定分泌抗人生长分化因子15(GDF15)单克隆抗体(m Ab)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的m Ab进行鉴定。方法:根据人GDF15氨基酸序列特征,设计合成了8条能够免疫产生GDF15特异性抗体的抗原多肽,与VLP载体偶联后,免疫雌性BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备鼠源抗人GDF15的m Ab,用间接ELISA检测m Ab腹水效价。结果:获得针对7个抗原多肽的12株稳定分泌抗人GDF15的杂交瘤细胞系,腹水m Ab效价可达1×104~1×109。结论:获得了针对不同抗原多肽的抗人GDF15的特异性m Ab,为进一步研发以GDF15为靶点的单克隆抗体抗肿瘤药物奠定了基础。     

抗吡虫啉单克隆抗体的制备及鉴定

为制备灵敏度高,特异性强的抗吡虫啉单克隆抗体,建立经济、快速、准确的吡虫啉残留免疫学分析方法,采用分子模拟技术分析吡虫啉及其类似农药的电荷分布后,选择1-[6-(2-羧乙硫基-3-吡啶)甲基]-N-硝基-2-咪唑啉亚胺 (H1) 作为免疫半抗原,1-(6-氯-3-吡啶甲基)-3-羧丙基-N-硝基-2-咪唑啉亚胺 (H2) 作为包被半抗原,利用NHS酯法将H1和H2分别与牛血清蛋白 (BSA) 和卵清蛋白 (OVA) 偶联合成免疫原与包被原。免疫BALB/c小鼠后,采用常规杂交瘤技术共获得2株稳定分泌抗吡虫     

人β-actin蛋白原核表达及其单克隆抗体制备

为获得分泌抗人β-actin蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞,通过在大肠杆菌中原核表达人β-actin蛋白,以纯化的人β-actin蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞的融合及筛选获得1株能稳定分泌抗人β-actin蛋白McAb的杂交瘤细胞,命名为2B4。采用间接ELISA和Western blot方法对McAb的特异性、稳定性和适用范围进行鉴定。结果显示：蛋白的相对分子质量为43 kDa,可溶于8 mol/L尿素;杂交瘤细胞上清的抗体效价为1×10^5,腹水的抗体效价为1×10^7;间接ELISA结果表明,杂交瘤细胞在体外传20代或液氮冻存3个月后,分泌的抗体效价不变;37℃保存24 h后,抗体的效价开始下降。Western blot结果显示,单克隆抗体识别人、鼠、兔和鱼的β-actin蛋白,与其发生特异性反应。2B4分泌的单克隆抗体可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验,具有良好的应用价值。     

抗重金属汞离子抗体的制备及鉴定

汞、镉、铅等重金属引起的环境污染已在世界范围内造成危害。快速、廉价地监测生境中重金属是减小其对人类及动物危害的先决条件。传统检测方法无法满足高通量的现场检测,建立更快速、更经济的免疫分析法检测汞离子是生产及经济发展的需要。本研究中,报道了汞特异性单克隆抗体的制备与筛选方法和结果。因Hg2+太小以至于不能引起免疫反应,所以用螯合剂(二乙烯三胺五乙酸,DTPA)将金属离子与载体蛋白(匙孔血蓝蛋白,KLH)连接起来。成功合成、鉴定汞复合物抗原后,免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合获得了稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。用极限稀释法亚克隆,通过ELISA筛选,获得了2株稳定分泌抗汞离子抗体的细胞株(H2H5,H1H8)。小鼠腹腔注射1×107H2H5、H1H8细胞株制备腹水,腹水抗体效价都在1∶51200以上。经鉴定两株杂交瘤均为IgG1亚类,轻链为kappa型且分泌抗体稳定性较好。实验结果为汞离子残留免疫学检测方法的建立提供了技术基础,对提高风险评估工作的效率和质量,保障食品安全有重要现实意义。     

邻氯青霉素单克隆抗体的制备及特性鉴定

采用碳化二亚胺法,将邻氯青霉素（cloxacillin）与牛血清白蛋白偶联制备免疫原,免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术获得了一株能稳定分泌抗邻氯青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H8-B1-F4。间接ELISA方法测定,抗体亚类为IgG1,其细胞上清抗体效价为1：1000,腹水效价为1：4×105。与其结构类似物苯唑青霉素、双氯青霉素的交叉反应率为21.3％和19.6％,和氨苄青霉素、羟氨苄青霉素和苄青霉素无交叉反应。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。为进一步研制检测邻氯青霉素的 ELISA试剂盒奠定基础。     

人凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备抗人凝血因子Ⅶ单克隆抗体并鉴定其特性。方法：应用杂交瘤融合技术,以重组人凝血因子Ⅶ为抗原免疫BALB／c小鼠;取免疫小鼠的脾细胞与Sp2／0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA法筛选、融合细胞有限稀释法克隆、克隆化杂交瘤细胞株的亚类鉴定等方法筛选出单克隆抗体杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特异性进行鉴定;用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行单抗的纯化。结果：获得了3株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞3E8、3D2和1C5,诱生的腹水效价分别为1：1×10^7、1：1×10^6和1：1×10^6;亚类鉴定表明388为IgG2a,其余2株均为IgGl;特异性鉴定显示它们与多种血浆蛋白均无交叉反应,表明单抗是特异的;经过亲和层析,获得了纯化的单抗。结论：获得了特异性的人凝血因子Ⅶ单克隆抗体,为建立人凝血因子Ⅶ检测及纯化方法奠定了基础。     

Production and characterization of monoclonal antibody and its recombinant single chain variable fragment specific for a food-born mycotoxin, fumonisin B1

Fumonisin B₁ (FMB₁) is a food-born mycotoxin produced by Fusarium moniliforme. Monoclonal antibody against FMB₁ (anti-FMB₁ mAb) was produced in the hybridoma DV9, which was established from a BALB/c mouse immunized with bovine serum albumin conjugated FMB₁ (FMB₁-BSA). A competitive direct enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) showed that anti-FMB₁ mAb has about 10 ppb of minimum FMB₁ detection concentration and 220 ppb of 50% inhibition concentration (IC₅₀). Much lower cross-reactivity of anti-FMB₁ mAb on ochratoxin A, aflatoxin B₁ and deoxynivalenol provided that anti-FMB₁ mAb was specific for FMB₁. The gene coding single chain variable fragment against FMB₁ (anti-FMB₁ scFv) was cloned from the hybridoma DV9 and was expressed in recombinant Escherichia coli. Insoluble anti-FMB₁ scFv required optimization of its refolding condition, and hence functional scFv was obtained. By using indirect ELISA, about 12-fold lower binding activity of anti-FMB₁ scFv on FMB₁-BSA was obtained in comparison with that of the parental mAb.     

抗心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体制备、鉴定和在侧向免疫层析方法中的应用

目的:制备抗心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)单克隆抗体(mAb),并建立侧向免疫层析方法检测血浆中H-FABP。方法:用H-FABP蛋白免疫纯系Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术建立能稳定分泌抗人H-FABP的单克隆杂交瘤细胞株。常规制备腹水,纯化后得到特异性抗H-FABP单克隆抗体,进行效价、特异性、亲和力的鉴定分析,并在ELISA平台进行抗体配对,用所筛选到的抗体对初步建立了检测H-FABP的侧向免疫层析方法。结果:成功获得12株稳定分泌抗体的阳性细胞株,并筛选出能相互配对,并应用于侧向免疫层析平台的抗体3D1和5F4,检测临床样品与对照试剂比较总符合率为100%。结论:筛选能稳定分泌抗体的细胞株,配对抗体应用于侧向免疫层析检测方法中,能快速、特异、灵敏的检测出临床样品中H-FABP,为临床应用快速检测H-FABP指标提供了方法和关键材料。     

19-去甲睾酮异源性ciELISA试剂盒的研制及应用

筛选抗19-去甲睾酮（NT）单克隆抗体,建立异源性ciELISA试剂盒。用人工抗原NT-17-BSA免疫Balb/C小鼠,细胞融合技术建立1株抗NT单克隆杂交留细胞NT1-B7,同种型为IgG1 /k,腹水效价达0.64×105,亲和常数（Ka）为4.31×109 L/mol,半数抑制浓度（IC50）为0.55 ng/mL,与群勃龙和雌二醇的交叉反应率（CR）分别为2.2%和1.6%,与其它化合物无CR。异源性ciELISA试剂盒在猪肉、猪尿、牛肉和牛尿四种基质中的检测限分别为0.24、0.23、0.22和0.17 ng/mL,批内和批间相对标准差（RSD）在4.4％～21.8％,添加回收率在85％～110％,4 ℃下保存期至少6个月。NT-Kit的基质pH值适用范围为6.5～7.5,温育过程优化后可节约检测时间30～90 min。试剂盒灵敏度高、特异性强,可应用于样品基质中NT残留检测。     

TT病毒重组蛋白单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,获得了4株稳定分泌抗TTV重组蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,1株属IgG2bλ链、1株属IgG1κ链、2株属IgG2aκ链。4株杂交瘤细胞培养上清液效价为1：80-1：1280,腹水效价为1：32万-1：160万。