扩增大片段核酸的聚合酶链反应及其应用

本综述了扩增１０－４０ｋｂ大片段核酸的聚合酶链反应方法的原理,影响因素条件优化,以及ＬＡ－ＰＣＲ在扩增与克隆目的的基因、研究基因组的多态性和分别等方面的应用。     

人D-二聚体的制备及其冻干性质的分析

以人源纤维蛋白原为原材料制备D-二聚体,将其制成冻干品并分析其冻干性质。使用凝血酶、Factor XIIIa酶解纤维蛋白原,获得交联纤维蛋白。经纤溶酶降解交联纤维蛋白,生成纤维蛋白降解产物。超滤除去纤维蛋白降解产物中的小分子物质,可获得较高纯度的D-二聚体。通过筛选和优化冻干方案,将D-二聚体制备成冻干品。经检测可知,D-二聚体冻干品可在37℃稳定保存12 d;复溶后在25℃稳定保存8 d;复溶后在4℃稳定保存30 d;复溶时,常用复溶溶剂对其复溶后的活性检测无明显影响。     

甲胎蛋白的原核表达及复性优化

构建甲胎蛋白的原核表达载体p ET32a-AFP,对包涵体形式表达的甲胎蛋白进行复性优化。将构建的重组质粒p ET32a-AFP转化入E.coli,IPTG诱导表达后,经亲和层析纯化获得AFP包涵体,通过对复性过程、p H、添加剂等的研究摸索,获得最佳复性条件。当采用添加0.5 mol/L L-精氨酸的一步法透析复性方法,且透析液p H值为8.5,重组人AFP包涵体蛋白起始浓度为1.0 mg/m L时,复性效率最高。该复性方法获得蛋白质具有较高的回收率且操作简便。     

重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其冻干质控品的制备

旨在为市场提供一种廉价、稳定、特异性强、灵敏度高的肌红蛋白质控品;将密码子优化后的肌红蛋白序列通过两步法进行化学合成,并连接到pET-28a表达载体上,转入大肠杆菌BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导表达;目的蛋白经Ni Sepharose 6 Fast Flow(FF)亲和层析进行纯化后,对其特异性进行检测,并研究蛋白稀释液的配方和优化冻干工艺,最后对冻干质控品的稳定性进行检测;结果显示目的蛋白分子量大小为20 kD左右,具有较强的特异性。蛋白冻干后具有很好的形态,37℃可以稳定保存10 d;25℃、4℃可以稳定保存4个月以上。该蛋白的冻干制品成本低、稳定性好、特异性强、灵敏度高,可用于定性定量肌红蛋白检测试剂盒的质控品。     

人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的原核表达、纯化和冻干品的制备

目的:获得重组人心型脂肪酸结合蛋白,分析其活性及制备冻干品。方法:从GenBank中检索人源H-FABP CDs序列,合成基因后构建原核表达载体pET-28a(+)-H-FABP。将表达载体转入E.coli BL21(DE3),摸索pET-28a(+)-H-FABP最佳诱导条件,表达并纯化重组蛋白。使用检测试剂检测纯化后的重组H-FABP活性,研究最佳冻干方案并考察冻干品的稳定性。结果:经过优化诱导条件,重组H-FABP在BL21(DE3)中以可溶性蛋白形式表达。诱导条件为OD600≈0.6,IPTG终浓度0.4mmol/L,30℃诱导4h。通过Ni2+亲和层析纯化可得到纯度大于95%的重组HFABP蛋白。重组H-FABP冻干品可以在37℃稳定保存12d,25℃、4℃稳定保存至少4个月。结论:本项研究中的重组H-FABP表达体系成熟、蛋白活性高,冻干品稳定性好,为后续研究提供了稳定高效的生物原材料。     

丙型肝炎病毒翻译及调控机制

丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）是单股正链ＲＮＡ病毒,有单一阅读框架,编码约３０１０个氨基酸的病毒前体蛋白。ＨＣＶ基因组结构和病毒蛋白的亲疏水性与黄病毒相似,因此将其归于黄病毒科丙型肝炎病毒群［１］。与黄病毒不同的是,ＨＣＶ５′...     

HCV感染者抗HCV抗体产生的不均匀性与B细胞优势克隆

本文采用抗原捕捉ＥＬＩＳＡ方法检测了ＨＣＶ感染者血清中抗－ＨＣＶＩｇＧ抗体轻链Κ和λ的比值,发现所检测的抗ＨＣＶ－ＮＳ４、抗ＨＣＶ－ＣＰ１和抗ＨＣＶ－ＣＰ２抗体轻链的表达呈现明显的偏斜,６５例抗ＨＣＶ阳性者中６３例（占９６．９％）,至少一种抗ＨＣＶ抗体К／λ偏离了正常１∶１的比值,尤以λ链较多,分别占６５．６％、８９．９％和７０．２％,但任何一个ＨＣＶ感染者血清抗－ＨＣＶ抗体既可能是Κ链占优势,也     

抗心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体制备、鉴定和在侧向免疫层析方法中的应用

目的:制备抗心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)单克隆抗体(mAb),并建立侧向免疫层析方法检测血浆中H-FABP。方法:用H-FABP蛋白免疫纯系Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术建立能稳定分泌抗人H-FABP的单克隆杂交瘤细胞株。常规制备腹水,纯化后得到特异性抗H-FABP单克隆抗体,进行效价、特异性、亲和力的鉴定分析,并在ELISA平台进行抗体配对,用所筛选到的抗体对初步建立了检测H-FABP的侧向免疫层析方法。结果:成功获得12株稳定分泌抗体的阳性细胞株,并筛选出能相互配对,并应用于侧向免疫层析平台的抗体3D1和5F4,检测临床样品与对照试剂比较总符合率为100%。结论:筛选能稳定分泌抗体的细胞株,配对抗体应用于侧向免疫层析检测方法中,能快速、特异、灵敏的检测出临床样品中H-FABP,为临床应用快速检测H-FABP指标提供了方法和关键材料。