牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清白蛋白(BSA)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,培养上清经过双抗体夹心法检测初步筛选分泌鼠IgG的杂交瘤细胞,将此种杂交瘤细胞注射小鼠产生的腹水用间接ELISA法筛选,获得4株能稳定分泌抗BSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2A5、3A3、3G6、4A8。鉴定结果显示,2A5细胞分泌IgG2a/κ,其余3株细胞分泌IgG1/κ;纯化后4株腹水单抗的纯度达90%以上,对BSA的ELISA滴度均可达到1∶100000以上;4株单抗均不与人以及马、猪、羊、兔、豚鼠等血清发生交叉反应;W estern B lotting试验证明4株单抗均识别分子量为68000的BSA;用间接ELISA法测定4株单抗相对亲和力及相对敏感度大小依次为3A3>2A5>3G6>4A8;杂交瘤细胞株连续培养3个月以及冻存半年后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。     

百合无症病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用百合无症病毒(Lilysymptomlessvirus,LSV)免疫的BALBC鼠脾细胞与SP20鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗LSV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞(2A2、5H9、5H2和5E12),并分别制备它们的单抗腹水。4株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,5H9和5E12的抗体类型及亚类均为IgG1,而2A2和5H2均为IgG3,4株单克隆抗体的轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测LSV的方法。病叶作1300倍稀释、提纯LSV病毒浓度为18ngmL(每孔的病毒绝对量为1.8ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA检测了田间样品,发现LSV在百合上发病很普遍。     

Tropic1808基因重组蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法：用Tropic1808基因重组蛋白作为抗原免疫BALB/C小鼠,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤（SP2/0）细胞融合,经ELISA筛选和有限稀释法获得分泌单克隆抗体的细胞株,Western Blot等方法对其生物学特性进行鉴定。结果：获得2株识别Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体的细胞株Ⅱ4B、Ⅲ4C。WesternBlot法显示该抗体特异性地识别Tropic1808基因重组蛋白;ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清及体内成瘤后产生的腹水的抗体效价分别为1：80、1：600;杂交瘤细胞染色体数平均为90-100;亚类鉴定单抗的重链为小鼠IgG1,轻链为κ型。结论：成功地制备了Tropic1808基因重组蛋白的单克隆抗体,为进一步研究Tropic1808基因重组蛋白的功能提供了良好的基础。     

幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗幽门螺杆菌尿素酶B单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法:用初步纯化的重组幽门螺杆菌尿素酶B免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备抗尿素酶B的mAb,用间接ELISA检测mAb的特异性和亲和力,检测mAb腹水效价,鉴定Ig亚类并测定其抗原决定簇。结果:获得8株能稳定分泌抗尿素酶B的mAb杂交瘤细胞系,这8株单抗与能产生尿素酶的小肠结肠耶尔森氏菌、肺炎克雷伯氏菌和普通变形杆菌均无交叉反应,相对亲和力为1.13×10-8～4.66×10-10,腹水mAb效价可达2×104～3.2×105。其中2株单抗属IgG1亚类,3株单抗属IgG2a亚类。8株单抗分属于3种不同的抗原决定簇。结论:获得了IgG1和IgG2a类型的针对3种不同抗原决定簇的特异性幽门螺杆菌尿素酶B的mAb,为进一步用于幽门螺杆菌的临床诊断和实验研究创造了条件。     

F型肉毒毒素单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备F型肉毒毒素(BoNT/F)鼠源单克隆抗体。方法:以BoNT/F重链C端(BoNT/FHc)为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后尾血效价最高小鼠的脾脏细胞与鼠骨髓瘤细胞Sp2/0在聚乙二醇作用下进行细胞融合,ELISA筛选阳性细胞孔,通过有限稀释法分离能稳定分泌抗体的细胞株。小鼠腹腔注射杂交瘤细胞制备的腹水利用Protein G进行亲合层析纯化,SDS-PAGE检测抗体纯度,非竞争ELISA测定抗体亲和力常数,亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型,PCR扩增抗体轻重链可变区基因并经Vbase软件分析抗体框架区与互补决定区(CDR)氨基酸序列。结果:经过3轮免疫后,5只小鼠尾血效价均达到1∶16 000,其中2号鼠尾血效价最高;杂交瘤细胞融合率为74.48%,阳性率为11.54%;2轮克隆化后筛选得到7株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,选择其中细胞培养上清效价最高的1F4制备抗体;腹水纯化后1F4抗体纯度超过95%,与BoNT/FHc抗原的亲和力常数为1.08×10-8mol/L;亚型鉴定结果表明1F4重链和轻链分别为IgG1型和κ型,抗体可变区氨基酸序列分析显示1F4重链和轻链CDR3序列为TRHGYFPSWFAY和QQHYSTPWT。结论:筛选到一株高亲和力的鼠源单克隆抗体,为BoNT/F检测和中和抗体的研发奠定了基础。     

应用环磷酰胺研制细胞表面抗原的单克隆抗体

利用环磷酰胺和杂交瘤技术 ,成功制备了 1株稳定分泌抗人CD80 分子单克隆抗体的杂交瘤细胞。实验结果表明 ,该单抗腹水效价为 1 0 6 ,属IgG1亚类 ,特异性强 ,为今后的应用打下了基础。     

P2X7受体短肽单克隆抗体的制备及鉴定

旨在制备与鉴定鼠抗P2X7受体的蛋白单克隆抗体.以人P2X7受体的胞外段制备短肽作为抗原,皮下注射免疫Balb/c小鼠.分离小鼠脾脏B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合并培养,挑选阳性杂交瘤细胞,扩大培养,制备和鉴定P2X7其生物学效应.结果显示,获得1株稳定分泌抗人P2X7受体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG1,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶6.4×104;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western blotting检测证明该单抗与人细胞表面的P2X7受体蛋白特异地结合.所制备的抗人P2X7受体的单克隆抗体具有高度的特异性及稳定性,为针对P2X7受体为靶点的抗体药物的开发应用、疾病的辅助诊断奠定了基础.     

人突触囊泡蛋白2C单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备人突触囊泡蛋白2C(SV2C)单克隆抗体。方法:纯化SV2C/L4蛋白,免疫BALB/c小鼠并制备杂交瘤细胞,筛选针对SV2C/L4的特异性抗体,鉴定亚型及测定效价;选取效价最高的抗体进行大量制备,并经SDSPAGE、Western印迹、间接ELISA和动物实验对抗体纯度、特异性、亲和力及中和活性进行检测。结果:得到纯度大于95%的SV2C/L4蛋白,经2轮筛选共获得13株鼠单抗,抗体重链大多为IgG1、IgG2a型,轻链均为κ型;选取效价最高的30号抗体进行大量制备,纯化后抗体的纯度大于99%,亲和力为6.7 nmol/L,中和活性为100 LD50/mg。结论:筛得1株高亲和力、具有中和活性的特异性SV2C鼠单抗,为肉毒中毒的治疗提供了新的选择,也为阐明Bo NT/A受体间的关系奠定了基础。     

抗传染性犬肝炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备传染性犬肝炎病毒单克隆抗体。方法将用纯化的犬腺病毒1型（CAV-1）免疫的BALB／c小鼠脾细胞与SP2／0细胞在聚乙二醇作用下融合,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫酶试验（1EA）筛选,以有限稀释法克隆3次,制备单克隆抗体,并对制备完成的单克隆抗体进行生物学鉴定。结果成功得到2株能稳定分泌抗CAV-1的单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为1B、2H3,经鉴定其亚型分别为IgG2a和IgG2a,2株均为kappa链。腹水的ELISA效价可达10^7-10^8,IEA效价可达1：2560—1：5120。该单克隆抗体与CPV、CDV、FPV、CCV病毒无交叉反应。结论成功制备了抗CAV-1单克隆抗体,为进一步建立相关诊断方法奠定了基础。     

重组人红细胞生成素单克隆抗体的制备

本文应用常规淋巴细胞杂交瘤技术制备了4株能稳定分泌抗人重组红细胞生成素(rHuEPO)单克隆抗体(McAb)的小鼠杂交瘤细胞系:BⅡ1B5、DⅡ6B9、MⅡ1H4、GⅠ3E7,用鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定,其分泌的McAb的类型分别是:IgM、IgM、IgG1和IgG2a。间接ELISA法测定细胞上清的效价为1×10~(-2)～1.25×10~(-1),腹水效价为1×10~(?)～1×10~(?)。培养上清经ELISA鉴定,与IL-2、GM-CSF、IFN-α等细胞因子均无交叉反应。只与rHuEPO特异性结合。     

抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的:制备抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体。方法:采用杂交瘤技术,获得2株针对重组黄曲霉尿酸氧化酶(rUOX)的杂交瘤细胞McAb17和McAb3;采用盐析和A蛋白亲合层析柱纯化该抗体。结果:McAb17和McAb3的腹水效价达到1∶512000,纯化后获得纯度大于95%的单抗,抗体亚类(型)分别为IgG1/k型和IgG2a/k型;ELISA结果显示制备的单抗与rUOX和Rasburicase(商品化rUOX)可发生特异反应。结论:制备了抗黄曲霉尿酸氧化酶单克隆抗体McAb17和McAb3,为检测rUOX在动物体内的代谢变化提供了良好的实验基础。     

抗人α2a型基因工程干扰素单克隆抗体及亲和层析柱的研制

应用鼠－鼠杂交瘤细胞技术建立了三系稳定分泌抗重组人α２ａ型干扰素（ｒＨｕ－ＩＦＮ－α２ａ）单克隆抗体细胞系１Ａ５、１Ｂ５和２７Ａ７。细胞连续传代和在液氮中冻存后复苏,分泌抗体能力不变,并且维持在较高水平,细胞培养上清效价１∶２５６～１∶４０９６,腹水１∶２６×１０５～１∶２７×１０８。Ｉｇ亚类测定,１Ａ５和１Ｂ５ＭｃＡｂ为ＩｇＧ１,２７Ａ７为ＩｇＧ２ａ。三系ＭｃＡｂ均识别ｒＨｕ－ＩＦＮ－α２ａ和－α２ｂ,与ｒＨｕ－ＩＦＮ－α１和正常大肠菌体裂解液无反应。竞争ＥＬＩＳＡ试验,三系ＭｃＡｂ分别针对ｒＨｕ－ＩＦＮ－α２ａ上三个不同表位。同ＭｃＡｂ建立双抗体夹心ＥＬＩＳＡ对ｒＨｕ－ＩＦＮ－α２ａ和－α２ｂ均可检测到１５０ｐｇ／ｍｌ,约１０ＩＵ／ｍｌ的敏感度。用提纯的单抗制备亲和层析柱,单抗偶联率９５％以上。三系单抗亲和层析柱均可将粗制ｒＨｕ－ＩＦＮ－α２ａ提纯到９７％以上纯度。平均回收率为：１Ａ５单抗柱９０２％,１Ｂ５单抗柱９５３％,２７Ａ７单抗柱９４７％。比活性平均值依次为１９４×１０８ＩＵ／ｍｇ,１９７×１０８ＩＵ／ｍｇ和１６４×１０８ＩＵ／ｍｇ,残余鼠ＩｇＧ量均符合规程要求。纯化ｒＨｕ－ＩＦＮ?     

抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:获得分泌抗H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。方法:以H9N2亚型AIV为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14,在PEG4000的作用下进行细胞融合,通过血凝抑制(HI)试验筛选分泌抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果:经过连续3～4次克隆化,获得能稳定分泌抗H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体细胞系6株,分别命名为1B2、1C10、1G2、2B7、2E3和5E11。6株细胞培养上清HI效价为24～28,腹水HI效价为210～213。除1G2为IgM外,其余5株均为IgG1。Western blotting结果显示,1B2、1C10、2B7和2E3能与AIVH9蛋白在Mr为75000处反应,表明其是针对AIVH9亚型血凝素蛋白的单抗。特异性试验表明该6株单抗均只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他14个HA亚型的AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性。结论:制备了针对H9亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,为禽流感的快速诊断和病毒的抗原性分析等奠定了基础。     

猪戊型肝炎病毒重组蛋白ORF2-V1单克隆抗体的制备及抗原表位差异分析

用纯化的猪戊型肝炎病毒DQ株重组蛋白ORF2-V1免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行融合,经3次克隆和间接ELISA 筛选,获得了αC11,αC12,γH1,γF8,BC4和CH8 6株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过间接ELISA 测定,单抗效价为: 细胞培养上清1∶1.60×103～1∶3.20×103,腹水为1∶1.28×106～1∶2.56×106; 经ELISA法测定,6株单克隆抗体均与重组蛋白ORF2-V1反应, 而不与ORF2其它部分片段的蛋白反应; 将试验中制备的MAbs分别用HEV swDQ株感染的A549细胞涂片进行IFA检测,同时分别用猪的阳性、阴性血清和SP2/0细胞上清做对照,制备的6株MAbs对感染细胞均呈现阳性反应,说明其可以与天然的病毒发生反应,并且与阳性多克隆血清比较,以单克隆抗体为一抗,IFA反应表现出良好的特异性。单抗的亚类鉴定结果表明,所有MAbs均为IgG1型,而且所有单克隆抗体的轻链均为κ链。单克隆抗体抗原识别位点分析结果表明,6株单抗分别针对4个不同抗原位点,McAb-γH1,BC4,CH8识别的位点各不相同,其中McAb-γH1,BC4识别的位点有部分重叠,McAb αC11,αC12,γF8识别同一位点,位于γH1,BC4识别位点的重叠区内。     

重组恶性疟原虫DNA质粒免疫小鼠制备单克隆抗体

用恶性疟原虫MSP131基因片段的重组质粒DNA直接免疫BALB/c小鼠,诱导产生体液,免疫后取脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG1450作用下进行融合,获得了2株能分泌抗恶性疟原虫MSP131单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株9H9和8A2。用酶联免疫吸附试验检测,小鼠腹水抗体滴度最高为1∶10 000。经免疫球蛋白类型和亚类鉴定,2株杂交瘤细胞株均为IgG\-1\.蛋白免疫印迹试验表明,此单克隆抗体与MSP1\|31蛋白抗原有特异免疫反应,证明通过质粒DNA直接免疫小鼠可制备特异性单克隆抗体。     

抗牛血清IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

用牛血清IgG免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用含山羊血清的培养基培养细胞,上清用间接ELISA法筛选。获得4株能稳定分泌抗牛血清IgG的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为1G5、2A8、3F5、4C5。其中2A8为IgG2a,其余3株为IgG1;腹水单抗的ELISA滴度均超过10-5;除3F5株单抗与山羊血清有交叉反应外,1G5、2A8、4C5株与人、马、猪、羊、兔、豚鼠等血清均不发生交叉反应;4株单抗与制备病毒性疫苗的基质液呈阴性反应;4株单抗识别分子量为160kD的牛血清IgG的两个不同抗原表位;4株单抗相对亲和力大小依次为4C5>2A8>1G5>3F5,相对敏感度依次为2A8>4C5>3F5>1G5;4株杂交瘤细胞株的染色体计数均大于90条,连续培养三个月以及冷冻保存半年后复苏,细胞生长良好。使用这些单抗建立的双抗体夹心法检测生物制品中的残留牛血清IgG。     

抗人IgM单克隆抗体的研究—脾内免疫建立抗人IgM单克隆抗体杂交瘤细胞株

用多发性骨髓瘤病人血清中提纯的ＩｇＭ抗原,用脾内免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠后与Ｓｐ２／Ｏ骨髓瘤细胞融合,获得了７株分泌人ＩｇＭ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为２５Ｇ１、２５Ｇ３、２５Ｇ４、２５Ｇ５、２５Ｄ２、２５Ｄ３和２５Ｄ５。注射同系小鼠后可诱生含较高效价抗人ＩｇＭ腹水（ＰＨＡ＝１２１２）。该杂交瘤细胞经组织培养传代半年,冻存１４个月后复苏,其分泌ＩｇＭ性能稳定。用ＰＨＡ、ＥＬＩＳＡ做人ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ阻断试验,仅ＩｇＭ可阻断。用琼脂糖双扩散证明其与羊抗人ＩｇＭ有共同沉淀线     

猪源马链球菌兽疫亚种表达的类M蛋白黏附抑制性单抗的获得

根据马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)猪源株ATCC35246株的类M蛋白基因序列,通过PCR技术,扩增出无信号肽的类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a( )中。重组质粒经酶切鉴定和测序后,在大肠杆菌BL21中表达,获得60kDa产物,Western blot显示,其与ATCC35246株多克隆抗血清反应,抗原性良好。以His亲和层析柱纯化重组类M蛋白作为抗原免疫8周龄的BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备了12株稳定分泌抗类M蛋白单抗的细胞株,特异性检测显示其与A群链球菌、猪链球菌2型以及马链球菌马亚种等没有交叉反应。单抗亚类鉴定显示,其中6株为IgG1,3株为IgG2,另外3株为IgM。从腹水中纯化的单抗效价为2.56×104~1.01×105。黏附抑制实验显示,其中一株单抗能阻断类M蛋白黏附HEp-2细胞。     

EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。