依据乳蛋白基因序列构建反刍动物种系发生树的研究

依据牛的４种乳蛋白（α－乳清蛋白、β－乳球蛋白、β－和К－酪蛋白）基因已知序列设计引物,用ＰＣＲ的方法扩培并生测定了牦牛α－乳清蛋白全序列（２９９９ｂｐ）,水牛的α－乳清蛋白基因全序列（２７８４ｂｐ）,东北马６鹿的α－乳清蛋白基因部分序列（１５８２ｂｐ）,β－酪蛋白基因的５’侧翼序列（９８７ｂｐ）和第４￣第９外显子区序列（１０９０ｂｐ）、β－乳球蛋白５’侧翼序列（２１６７ｂｐ）,３’端侧翼序列（１     

T细胞中IL-3基因表达调节的转录因子初探

主要利用凝胶迁移率试验和抗体超迁移试验,以ｈＩＬ－３基因５′侧翼含κＢ位点的序列为探针,探究ＮＦ－κＢ是否参与了ｈＩＬ－３基因的表达调节．结果表明,在Ｊｕｒｋａｔ细胞和人外周血Ｔ淋巴细胞中,都存在与此序列特异结合的可诱导蛋白;ＮＦ－κＢｐ６５亚基的单抗对ＤＮＡ－蛋白复合物的形成没有影响．这些结果揭示：正常细胞和肿瘤细胞中,确存在可特异识别ｈＩＬ－３基因５′侧翼的κＢ顺序的蛋白因子,而且该蛋白因子的表达是可诱导的;但ＮＦ－κＢ并未参与ＩＬ－３基因的表达调节．     

羊BLG基因5′和3′调控区克隆及其调控GFP基因在乳腺细胞的表达

乳球蛋白 (ＢＬＧ)是反刍家畜的一种主要乳清蛋白质。将外源基因置于ＢＬＧ 5′调控区下游 ,能够控制外源基因在动物乳腺的组织特异性表达。现已清楚在ＢＬＧ 5′端有多个乳核因子 1(ＮＦ1)和转录因子Ｓｔａｔ5的识别位点 ,此外还存在多个激素作用位点[1 ] 。具有这些调控成分的ＢＬＧ 5′翼端 (5′ｆｌａｎｋｉｎｇ)能够控制外源基因在乳腺的表达 ,但受整合位点、外源基因结构以及转基因拷贝数及其排列方式的影响[2 ] 。研究结果表明 ,仅含有 5′调控区的乳腺表达构件 ,还不能使外源基因的表达达到内源性ＢＬＧ的表达水平 ,因为在 5′远端(…     

人纤溶酶原饼环区5基因的原核表达及活性测定

 人纤溶酶原饼环区 5 (hPgnK5 )是新的血管生成抑制因子 .PCR法改造hPgnK5基因 ,所得hPgnK5基因包括编码人纤溶酶原C4 62 到P54 4共 83个氨基酸残基 ,而且在 5′ ,3′分别引入了EcoRⅠ和BamHⅠ位点 .以pThiohisA构建hPgnK5基因原核表达载体 ,在大肠杆菌TOP10中表达该蛋白 .通过柱层析法获得hPgnK5纯化蛋白 .免疫印迹反应表明该蛋白具有hPgnK5免疫活性 .体外实验表明 ,该蛋白具有抑制血管内皮细胞增殖活性 .提示hPgnK5可能具有良好应用前景     

团头鲂nanos3基因的克隆鉴定

为了标记团头鲂(Megalobrama amblycephala)的原始生殖细胞(Primordial Germ Cells, PGCs), 首次克隆并鉴定了团头鲂nanos3基因(mananos3)。mananos3全长1027 bp, 包括48 bp 5′UTR (5′untranslated Region), 490 bp 3′UTR和489 bp开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)。该基因编码162个氨基酸。通过序列比对发现Mananos3蛋白和其他物种Nanos蛋白一样, 存在一个保守的RNA结合功能域, 该功能域包含一个锌指基序(Motif)。系统发育树结果显示, Mananos3与鲤(Cyprinus carpio)的Nanos3最为相近。半定量和定量PCR结果表明, mananos3具有较高的母源表达, 并在胚胎发育早期高量表达, 而在1000细胞期之后表达量逐渐降低。在成体组织中, mananos3仅在卵巢中检测到表达。mananos3和斑马鱼(Danio rerio) nanos3 (zfnanos3)的3′UTR均可以介导绿色荧光蛋白特异标记团头鲂和斑马鱼胚胎发育早期的PGCs, 但是mananos3的3′UTR能够更特异地标记团头鲂的PGCs。通过比对mananos3和zfnanos3的3′UTR发现, mananos3 的3′UTR中有一个非经典的miR430识别位点(GCACTA)。通过对该位点的突变研究证实其有利于nanos3在非PGCs组织中的降解。综上所述, 团头鲂mananos3的3′UTR序列中的非经典miR430识别位点(GCACTA)可能与介导报告基因在PGCs中特异表达相关。     

牦牛CSRP3基因的克隆及组织表达分析

CSRP3基因(Cysteine and glycine-rich protein 3,CSRP3)编码CRP3蛋白,是一个肌发生的正调节因子,可通过多种方式在肌肉发育和肌肉细胞结构维持中起重要作用。通过对牦牛CSRP3基因进行克隆及组织表达谱分析,为后续提高牦牛肉品质的研究提供基础数据。采用RT-PCR方法克隆牦牛CSRP3基因CDS区;再对其进行序列分析及蛋白结构和功能预测等生物信息学分析;最后利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在牦牛不同组织中的表达量。牦牛CSRP3基因CDS区长585 bp,编码194个氨基酸;CSRP3基因的系统进化树结果显示,牦牛与黄牛的亲缘性最近,其次是绵羊。牦牛CSRP3基因编码的蛋白为偏碱性不稳定亲水蛋白,无跨膜结构和信号肽,为非分泌蛋白,含有磷酸化位点22个,N-糖基化位点2个,O-糖基化位点7个;存在两个LIM结构域,属于LIM结构域蛋白质超家族成员,主要分布于细胞核中;二级结构以无规卷曲为主,三级结构的最佳模型为1b8t.1.A;实时荧光定量PCR结果显示,牦牛CSRP3基因在臀大肌中有较高表达量。生物信息学分析结果显示,CRP3蛋白含有两个LIM结构域,主要分布在细胞核中,实时荧光定量PCR结果显示牦牛CSRP3基因在臀大肌中具有较高表达量,为牦牛CSRP3基因在牦牛肉品质方面的调控机制研究提供了基础数据。     

牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH的扩增与生物信息学分析

旨在扩增牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH的编码基因,并预测OmpH蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH在免疫保护中所起的作用。对牦牛多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白OmpH基因进行PCR扩增及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH基因全长1 478 bp,ORF包含1 002 bp编码333个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和延伸带;推测OmpH蛋白有1个细胞黏附位点、2个糖基化位点。     

牦牛HORMAD1基因的克隆及生物信息学分析

利用分子克隆技术获得了牦牛HORMAD1基因编码区序列,并采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构等方面进行了预测和分析.结果表明,牦牛HORMAD1基因包含一个长度为1 182 bp的开放阅读框,编码393个氨基酸;其编码蛋白属于亲水性蛋白,无明显的信号肽,含有很多个磷酸化位点.二级结构主要以无规则卷曲和α螺旋为主.HORMAD1基因编码产物氨基酸邻接系统树表明,牦牛HORMAD1与黄牛、马和猪等物种的HORMAD1氨基酸遗传距离较近,具有高度相似性.     

牦牛PAFR基因生物信息学分析及其在妊娠前后子宫中的表达

以牦牛血小板活化因子受体(Platelet-activating factor receptor,PAFR)基因为研究对象,采取西宁家养牦牛子宫为材料,采用RT-PCR技术克隆牦牛PAFR基因,对其进行生物信息学分析,并采用QRT-PCR方法定量检测PAFR在牦牛子宫不同时期的表达。结果表明,牦牛PAFR基因编码区长1 029 bp,编码342个氨基酸;氨基酸序列与黄牛同源性最高为99.7%,与非洲爪蟾蜍同源性最低为59.1%,表明PAFR氨基酸在进化过程中具有保守性;其编码蛋白的氨基酸序列有5个跨膜区域,推测其可能为跨膜蛋白;具有亲水性;未发现信号肽片段;含有G蛋白偶联受体家族结构域;QRT-PCR检测PAFR在牦牛子宫中表达,妊娠期最高,卵泡期最低,黄体期居中,揭示其与胚胎附植,妊娠维持有关。     

草鱼AMBP基因cDNA的克隆与序列分析

α1-微球蛋白和Bikunin是由同一基因翻译表达出的两种功能不相关联的血浆蛋白。本文通过快速扩增cDNA末端的方法,首次从草鱼肝脏组织克隆了α1-微球蛋白和Bikunin前体蛋白(α1-microglobulin/Bulinin precursor, AMBP）基因全长cDNA。其cDNA全长1230bp,包含5′非翻译区23 bp,3′非翻译区160 bp和开放读码框1047 bp。开放读码框编码348个氨基酸,包含182个氨基酸的α1-微球蛋白和145个氨基酸的Bikunin。草鱼AMBP与其他物种的氨基酸序列分析结果表明,它们具有较高的同源性(44.7%－84.4%),其中草鱼与斑马鱼同源性最高(84.4%)。结果表明AMBP序列结构和α1-微球蛋白与Bikunin共翻译表达特点在动物机体中具有着重要的生理意义。     

苎麻小分子G蛋白Racl基因的克隆及表达分析

植物Rac是植物中特有的小分子G蛋白,我们从苎麻转录组中获得一个小分子G蛋白基因eDNA,．5部分序列,设计引物后采用RT-PCR结合RACE技术克隆了该基因的cDNA。序列分析表明,所克隆的RaclcDNA全长为l043bp,包括594bp开放阅读框、214bp的3’端非编码区和235bp的5’端非编码区,能编码一个197氨基酸的推导蛋白。该蛋白包含G蛋白典型的效应因子结合位点、GTP／GDP结合位点和碱性氨基酸区,c末端具有保守的异戊烯基化位,CSIL。采用半定量RT-PCR分析了该基因在5个苎麻品种及不同组织器官中的表达情况,结果表明Racl基因在苎麻根、茎、叶中均有表达,其中在叶中的表达量最高。纤维木质素含量不同的品种中,Racl基因的表达量存在明显差异。木质素含量高的品种具有较高的Racl基因表达,表明该基因可能在苎麻木质素合成过程中发挥作用。     

中国桔梗PgF3′5′H基因的克隆及表达分析

利用RT-PCR结合RACE技术,从中国桔梗(Platycodon grandiflorus)花朵中分离克隆了1个类黄酮-3′,5′-羟基化酶(flavonoid-3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)基因的全长cDNA序列,命名为PgF3′5′H(GenBank登录号JQ403611)。PgF3′5′H基因全长1 787bp,包含1个编码532个氨基酸长为1 599bp的开放阅读框。蛋白序列比对显示,PgF3′5′H基因蛋白与其他物种的F3′5′H蛋白有很高的相似性,包含有CYP基序、Ⅰ螺旋区和血红素结合区等保守性序列,以及一段类似于风铃草F3′5′H蛋白的9个氨基酸的特殊区。半定量RT-PCR结果显示,PgF3′5′H的表达量随着花朵发育和花色素的出现而呈递增趋势,在花发育第四阶段的蓝色花蕾中达到最高,而在叶中不表达。研究推测,PgF3′5′H基因可能在中国桔梗蓝色花色素的生化合成途径中起重要作用。     

大白菜碳酸酐酶基因的克隆与序列分析

以大白菜雄性不育系和保持系花蕾差异表达片段EST H9为信息探针,在GenBank数据库中进行同源EST序列检索,并对亲缘关系近的同源EST序列进行拼接,得到大白菜EST H9的5'-cDNA序列.根据拼接组装所得的5'-cDNA序列,进行3'-RACE引物的设计,经RACE扩增、测序,获得了大白菜α-碳酸酐酶3基因的cDNA全长序列并将其登录到GenBank(登录号为GU143061),命名为BrACA3.该cDNA全长998 bp,编码270个氨基酸.同源分析显示该cDNA序列推导的氨基酸序列与拟南芥α-碳酸酐酶3一致性达78%.氨基酸序列分析表明,该蛋白具备跨膜功能,在第19和20个氨基酸之间存在一个信号肽序列,存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点.在大白菜花蕾败育过程中α-碳酸酐酶3基因不表达,只在保持系B7的大花蕾时期表达.     

牦牛MC4R基因及其蛋白结构预测分析

根据普通牛MC4R基因序列设计同源引物,扩增克隆牦牛MC4R基因,对牦牛与普通牛MC4R基因及其蛋白结构进行生物信息学分析。与普通牛MC4R基因相比,牦牛在该基因存在5个多态位点,其中3个在密码子第3位,2个位点在密码子第1位;4个牦牛个体中有1个与其他个体存在2个变异位点且在密码子第3位;牦牛与普通牛在MC4R蛋白2个氨基酸的差异只引起两物种MC4R蛋白二级结构组分的细微差异。MC4R蛋白在牦牛和普通牛之间保守性较强,MC4R基因可能在哺乳类数百万年的进化历程中受到较强的进化抑制或净化进化。为研究MC4R基因在牦牛食欲控制、体重调节、脂肪沉积和能量平衡调节等方面提供基础资料。     

牦牛HSP72基因的结构及生物信息学分析

克隆测序了牦牛HSP72基因的全序列,并分析了该基因的结构,以及HSP72蛋白的氨基酸组成、等电点、亚细胞定位、跨膜区、疏水,亲水区、结构域、特征位点、密码子偏好性、二级结构等蛋白质性质。结果表明：牦牛的HSP72基因序列全长为1926bp,无内含子,共编码641个氨基酸;牦牛的HSP72基因和HSP72蛋白与普通牛、猪、人相比存在着一定差异,这可能是导致他们之间对温度适应性差异的主要原因之一。     

酵母转录因子PHO81基因的上游序列功能分析

利用ＰＨＯ８１ｌａｃＺ融合基因,对它的上游进行缺失分析,发现有两个区域对ＰＨＯ８１基因的表达是必需的：－４０１～－２８９ｂｐ和－１０１２～－８０１ｂｐ。比较ＰＨＯ８１和ＰＨＯ５,ＰＨＯ８４基因上游,未发现有较高同源性的序列存在,但在－４０１～－２８９ｂｐ区域有ＰＨＯ４蛋白结合位点的核心序列５′ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ３′,以及ＣＡＣＧＴＧ／Ｔ两侧富含Ａ／Ｔ的序列（可能是ＰＨＯ２结合位点）。推测－４０１～－２８９ｂｐ包含了ＰＨＯ８１的上游激活序列（ＵＡＳ）,－１０１２～－８０１ｂｐ可能起增强的作用。用酵母总蛋白质对－１０１２～－８０１ｂｐ进行凝胶阻抑电泳分析,证明有未知的蛋白因子结合在这个区域。     

一个小麦ω-醇溶蛋白基因同源序列的分离与序列分析

通过基因组PCR克隆了小麦济南177的一个ω-醇溶蛋白基因同源序列（ω1236）,该序列包括部分5′、3′ 侧翼序列和全部可能的编码序列,没有内含子,但在第87、117、125、160、198、313、357和365氨基酸残基处有终止密码子,所有8个终止密码的形成都是碱基转换的结果。比较分析发现,该序列与一个ω-醇溶蛋白基因序列（AB059812）有98%的同源性。推导的氨基酸序列表明该基因符合禾谷类醇溶蛋白的特点。系统进化分析表明,该序列与小麦ω醇溶蛋白在进化上亲缘关系较近,与α-,β-,γ-醇溶蛋白基因关系较远。ω1236推导的氨基酸序列编码了一个可能的47.2 kDa的蛋白质。转化大肠杆菌发现,在IPTG诱导后最初2 h,有小肽段产生,这说明在该基因序列中可能存在终止密码,这与测序结果是一致的。该研究为用PCR技术克隆ω醇溶蛋白基因和进一步研究ω醇溶蛋白基因的结构和功能积累了资料。     

牛催乳素基因组及其cDNA全长序列的分子克隆和分析

通过LongPCR等技术首次克隆得到全长9388bp的牛催乳素（bPRL)基因组序列（GenBank登录号AF426315）,其中包括bPRL基因全部5个外显子和4个内含子,5′端854bp的上游调控区以及3′端69bp的UTR,AF426315基因编码的蛋白质在GenBank中的序号为AAL28075,由229个氨基酸残基组成,1-30位氨基酸残基为信号肽序列,成熟的多肽含有199个氨基酸残基,将bPRL基因组DNA真核表达载体转染COS-7细胞后通过RT-PCR得到长度为804bp的bPRLcDNA序列,该序列涵盖了bPRL基因的全部ORF区,证明本研究所获得的bPRL基因组DNA具有转录的生物学功能,Blast搜索结果显示,GenBank数据库中收集有多条bPRL基因的mRNA和EST序列,各序列间存在多个SNP位点,主要分布于下游编码区和3′端的UTR,这些位点均未改变相应的氨基酸残基的性质,此外,5′端编码信号肽序列的区域呈现高度保守性。     

单核细胞增多性李氏杆菌野毒株InlB的分子特征及其表达和纯化研究

采用PCR技术扩增单核细胞增多性李氏杆菌TA野毒株内化素B(InlB)基因,进行编码分子的序列和结构分析,并克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中诱导表达。该基因全长1893bp,编码630个氨基酸,其中前35个氨基酸残基构成信号肽序列。在推导的InlB蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括1个α-螺旋的Cap结构域、6个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1个免疫球蛋白样结构域(IR)、1段B重复序列和3个串联的GW结构域,同时还存在5个潜在的N-联糖基化位点,Leu占所有氨基酸残基的10.2%。与GenBank已经报道的18个不同流行株InlB基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分别在91.1%~99.6%和92.3%~99.8%之间。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE和Western blot分析证实该基因已经正确表达。用Ni2 亲和层析柱纯化了InlB重组蛋白。     

Hepcidin的基因克隆及其在毕赤酵母中的分泌表达

根据已知hepcidin氨基酸序列,参照毕赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性,设计合成了hepcidin目的基因。所合成的hepcidin基因全长96bp,其5′端引入KEX2基因产物(Kex2)的特异性识别位点序列,以保证表达产物具有天然N端。通过基因重组的方法将hepcidin基因克隆到pPicZαA载体中,构建了分泌型重组酵母表达载体pPICZαA-Hepc,经电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500μg/mL的Zeocin筛选得到高拷贝插入GS115菌株,经摇瓶发酵和甲醇诱导,上清液有明显的hepcidin表达,表达量达到100mg/L。初步抗菌特性研究表明,该表达产物对枯草芽孢杆菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。