牦牛MC1R基因的克隆测序及其分析研究

以麦洼牦牛、斯布牦牛、天祝牦牛和九龙牦牛为研究对象,对黑色素皮质素受体1(Melanocortin receptor I,MCIR)基因编码区进行了克隆测序及分析.结果表明,牦牛的MC1R基因编码区全长954 bp,编码317个氨基酸:4个牦牛品种间及与普通牛间在MC1R基因的编码区内共有13个碱基差异,无碱基的插入和缺失现象,编码蛋白共有9个氨基酸差异.MC1R蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,有糖基化位点和7个跨膜区.系统进化分析显示,麦洼牦牛与斯布牦牛的MC1R基因相似性最近.本研究结果时今后开展MC1R基因与牦牛毛色性状的相关性分析以及牦牛的毛色遗传机理、基因定位、基因表达调控等研究具有重要的意义.     

牦牛CSRP3基因的克隆及组织表达分析

CSRP3基因(Cysteine and glycine-rich protein 3,CSRP3)编码CRP3蛋白,是一个肌发生的正调节因子,可通过多种方式在肌肉发育和肌肉细胞结构维持中起重要作用。通过对牦牛CSRP3基因进行克隆及组织表达谱分析,为后续提高牦牛肉品质的研究提供基础数据。采用RT-PCR方法克隆牦牛CSRP3基因CDS区;再对其进行序列分析及蛋白结构和功能预测等生物信息学分析;最后利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在牦牛不同组织中的表达量。牦牛CSRP3基因CDS区长585 bp,编码194个氨基酸;CSRP3基因的系统进化树结果显示,牦牛与黄牛的亲缘性最近,其次是绵羊。牦牛CSRP3基因编码的蛋白为偏碱性不稳定亲水蛋白,无跨膜结构和信号肽,为非分泌蛋白,含有磷酸化位点22个,N-糖基化位点2个,O-糖基化位点7个;存在两个LIM结构域,属于LIM结构域蛋白质超家族成员,主要分布于细胞核中;二级结构以无规卷曲为主,三级结构的最佳模型为1b8t.1.A;实时荧光定量PCR结果显示,牦牛CSRP3基因在臀大肌中有较高表达量。生物信息学分析结果显示,CRP3蛋白含有两个LIM结构域,主要分布在细胞核中,实时荧光定量PCR结果显示牦牛CSRP3基因在臀大肌中具有较高表达量,为牦牛CSRP3基因在牦牛肉品质方面的调控机制研究提供了基础数据。     

牦牛ZP3基因的克隆及蛋白质结构的预测

本研究对牦牛ZP3基因的编码区进行了克隆,在此基础上对ZP3蛋白的分子结构预测,为研究牦牛受精生物学提供基础。根据GenBank中普通牛的ZP3核苷酸序列设计特异性引物,以牦牛卵巢组织总RNA为模板,通过RT-PCR技术扩增牦牛ZP3基因cDNA序列(GenBank登录号为GQ856646),利用DNAMAN生物软件进行核苷酸和氨基酸序列分析、蛋白质专家系统ExPASy进行ZP3蛋白质分子结构预测。结果表明,扩增出的牦牛ZP3基因编码序列长1 266 bp,编码421个氨基酸。牦牛与牛、猪、狗、人、鼠和鸡ZP3基因核苷酸相应序列的同源性分别为98.42%、96.73%、79.67%、78.71%、69.15%和56.61%,氨基酸同源性分别为98.10%、83.85%、74.24%、70.26%、62.62%和46.12%,符合物种进化规律。预测的ZP3蛋白二级和三级结构显示它是一个具有22个氨基酸信号肽的亲水性β-桶状跨膜蛋白。牦牛ZP3基因编码区的成功克隆,为进一步研究该基因的结构与功能及其在受精过程中的作用提供了基础。     

牦牛PAFR基因生物信息学分析及其在妊娠前后子宫中的表达

以牦牛血小板活化因子受体(Platelet-activating factor receptor,PAFR)基因为研究对象,采取西宁家养牦牛子宫为材料,采用RT-PCR技术克隆牦牛PAFR基因,对其进行生物信息学分析,并采用QRT-PCR方法定量检测PAFR在牦牛子宫不同时期的表达。结果表明,牦牛PAFR基因编码区长1 029 bp,编码342个氨基酸;氨基酸序列与黄牛同源性最高为99.7%,与非洲爪蟾蜍同源性最低为59.1%,表明PAFR氨基酸在进化过程中具有保守性;其编码蛋白的氨基酸序列有5个跨膜区域,推测其可能为跨膜蛋白;具有亲水性;未发现信号肽片段;含有G蛋白偶联受体家族结构域;QRT-PCR检测PAFR在牦牛子宫中表达,妊娠期最高,卵泡期最低,黄体期居中,揭示其与胚胎附植,妊娠维持有关。     

牦牛α-乳清蛋白基因的克隆与序列分析

根据奶牛α－乳清蛋白基因序列设计引物,用PCR方法扩增并克隆了牦牛（Poephagens grunnieus）α－乳清蛋白基因的全序列。结果表明,在671－2689bp之间,共有4个外显子和3个内含子,牦牛α－乳清蛋白基因共编码142个氨基酸,其中第1－19氨基酸之间的短肽为信号肽序列。牦牛的α－乳清蛋白基因有较高水平的表达可能与基因内非编码序列碱基突变引起的回文结构消失有关。该基因5′侧翼序列在结构上牦牛和牛基本相同,只有MGF因子识别位点稍有差别。且牦牛的该序列更符合Groenen等1994年总结的该因子识别位点的模式序列,因此牦牛的该基因5′调控区可能更适于进行组织特异性表达的转基因动物的制作研究。     

牦牛MEF2C基因克隆、生物信息学及表达谱分析

本试验旨在分析牦牛(Bos grunniens)肌细胞增强因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)基因的分子特征和表达规律,探索其影响牦牛肌肉发育的作用机制.试验以大通牦牛肌肉组织cDNA为模板,采用PCR扩增技术扩增牦牛MEF2C基因,用DNAStar,ExPASy,ABCpred等生物信息学软件分析MEF2C基因序列和其编码的蛋白质结构,利用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测了 MEF2C基因的表达情况.试验克隆获得的牦牛MEF2C基因编码区全长1 302 bp,编码433个氨基酸;蛋白质结构预测结果显示,MEF2C蛋白具有30h的半衰期,为亲水性碱性蛋白,没有信号肽但拥有跨膜结构.系统关系中牦牛与普通牛的亲缘关系最为接近,与小鼠亲缘关系较远.组织表达谱结果显示,MEF2C基因在牦牛7个组织中都有表达且在臀二头肌组织中表达量最高;不同时期MEF2C基因表达情况为胎牛＞成年牛＞6月龄牛.研究结果将为进一步探讨MEF2C基因在牦牛肌肉发育中的作用提供科学依据,同时也为解析牦牛肌肉发育的分子机制提供数据支撑.     

牦牛MT-I/-Ⅱ cDNA分子克隆及其蛋白质结构分析

利用基因特异引物YMTSP1和YMTSP2,通过RT-PCR从牦牛肝脏组织RNA中克隆出了牦牛MT-Ⅰ(Genbank Accession NoAY513744)和MT-Ⅱ(Genbank Accession NoAY513745)基因编码区全长.将牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ cDNA序列在CBI上进行同源性搜索发现,牦牛MT-Ⅰ/-Ⅱ编码区序列在不同哺乳动物中相当保守.牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ编码的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白分别由61个氨基酸组成,其具有保守的短肽结构如C-X-C,C-C-X-C-C,C-X-X-C等,其决定MT蛋白分子的整个三维结构,在分子进化上十分保守.同时对牦牛MT的疏水性和跨膜区分析表明,牦牛MT蛋白可能不存在跨膜区,也不存在信号肽,是1种非分泌蛋白.并通过同源比较模建,预测和构建了牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ蛋白的分子空间结构,表明牦牛MT-Ⅰ和MT-Ⅱ由α-和β-两个结构域组成,在α-结构域含有5个Cys短肽结构,β-结构域有4个Cys短肽结构,且2个结构域由保守的三肽序列KKS相连.     

牛RHOQ基因的电子克隆与生物信息学分析

利用电子克隆技术获得牛RHOQ基因cDNA序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、信号肽、二级结构和亚细胞定位等方面进行预测和分析。结果表明,牛RHOQ基因的cDNA序列全长1 517 bp,包含1个618 bp开放阅读框,编码205个氨基酸;其编码蛋白属疏水性蛋白,不存在信号肽及跨膜结构,定位于分泌系统囊泡;二级结构主要以无规则卷曲和α-螺旋为主。牛RHOQ基因编码蛋白可能具有生长因子功能,可能在神经再生和突触延伸过程中起重要作用。     

牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH的扩增与生物信息学分析

旨在扩增牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH的编码基因,并预测OmpH蛋白二级结构和B细胞抗原表位,从而探讨牦牛多杀性巴氏杆菌外膜蛋白OmpH在免疫保护中所起的作用。对牦牛多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白OmpH基因进行PCR扩增及序列测定。应用生物信息学相关软件和方法,对牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白的二级结构和B细胞抗原表位进行预测。牦牛多杀性巴氏杆菌OmpH基因全长1 478 bp,ORF包含1 002 bp编码333个氨基酸。二级结构以无规卷曲为主,有少量的α-螺旋和延伸带;推测OmpH蛋白有1个细胞黏附位点、2个糖基化位点。     

β—1，3葡聚糖酶与糖体失活蛋白融合基因的制备及表达载体的构建

将大豆的β－1,3葡聚糖酶基因与玉米的核糖体失活蛋白基因通过一个6个氨基酸的柔性短肽链连接起来,形成1个融合蛋白。编码区基因长1830bp,共编码609个氨基酸和1个终止密码子。经过使用蛋白质分析软件Antheprot4.3和Prosis(v5.00）对融合蛋白的二级结构、理化特性、潜在信号肽断裂位点等方面进行分析表明：融合蛋白较好的保持了原来的两个蛋白的各项理化特性,维持了两种蛋白的二级结构。将此基因克隆质粒PBI121上,构建成植物表达载体PBI／GR。