抑癌蛋白PTEN的原核表达、抑癌活性研究和抗体制备

PTEN是具有蛋白质和酯类双重特异性磷酸酶活性的抑癌蛋白,在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。鉴于原核表达PTEN蛋白并用于抑癌实验的研究尚未见报道,因此尝试利用大肠杆菌表达有活性的PTEN蛋白,检测其抑癌效果。利用本室克隆的PTEN基因cDNA和原核表达载体pET44a( )分别构建带6×His和Nus标签的两种诱导型原核融合表达载体pETPTEN和pETNusPTEN,在不同的大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(简写为BL)和Rosettagami(DE3)pLysS(简写为RG)中诱导表达。SDSPAGE和Westernblot检测表明:在可溶性组分和包涵体中均含有目的蛋白,在BL中目的蛋白的表达量较高(18.7%)而在RG中可溶性蛋白的比例较高(6.6%)。经纯化和包涵体蛋白复性处理后,重组融合蛋白经Chariot转运入小鼠实体瘤及人前列腺癌DU145细胞。抑癌实验表明:与对照组相比,重组PTEN蛋白对小鼠实体瘤的生长抑制率为58.76%;对癌细胞DU145的生长抑制率可达46.16%;并可导致明显的G0G1期阻滞,其中在宿主RG中表达的重组蛋白抑癌效果明显高于BL宿主中表达的目的蛋白。证实在原核系统中表达的重组PTEN蛋白具有抑癌活性,同时制备了PTEN的高效价腹水多抗,为深入研究PTEN蛋白在癌症治疗中的应用打下了良好的基础。     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

新基因PRR11的克隆、原核表达及鉴定

克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其原核表达载体,并进行表达检测及鉴定.以Hela细胞cDNA为模板,RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入原核表达载体PET-28a中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组原核表达载体PET-28a-PRR11.然后把PET-28a-PRR11重组载体转化到BL21中,经IPTG诱导蛋白表达,提取细胞蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.结果表明成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到原核表达载体PET-28a中,目的蛋白成功表达.成功构建的PRR11基因的原核表达载体,及PRR11的重组蛋白表达产物,为进一步研究PRR11的基因功能奠定了基础.     

δ-睡眠肽与GFP融合蛋白的表达和纯化

构建δ-睡眠肽(DSIP)蛋白与GFP的融合基因表达载体,高效表达和纯化GFP-DSIP融合蛋白。通过SOE-PCR拼接DSIP全长编码基因,并使得DSIP上游具有肠激酶识别位点,经双酶切定向克隆至表达载体pET-28a,构建重组载体pET-28a-DSIP,通过PCR扩增GFP全长编码基因,经双酶切定向克隆至pET-28a-DSIP,构建原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,通过双酶切和测序鉴定后,导入E.coli BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,采用镍亲和层析和分子筛凝胶层析获得高纯度蛋白,SDS-PAGE分析鉴定。经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pET-28a-GFP-DSIP,在IPTG诱导下获得可溶性的绿色荧光蛋白与睡眠肽的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化成功获得高纯度的融合蛋白。成功构建了DSIP与GFP融合基因的重组表达载体,确定了GFP-DSIP融合蛋白诱导表达的最佳条件,获得了较高纯度的融合蛋白,为进一步研究DSIP蛋白的生物学功能奠定了基础。     

奶牛IL-6基因克隆与原核表达

目的:克隆新疆地区奶牛il-6基因.获得原核表达IL-6蛋白.方法:根据GenBank上牛IL-6的序列,用premier 5.0软件设计一对引物.以牛肺巨噬细胞提取的RNA反转录产物(cDNA)为模板扩增出567bp的条带,克隆到pBS-T载体,测序正确后,提取质粒经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切回收目的条带,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化DE3菌,经IPTG诱导表达.以表达产物免疫小白鼠血清为一抗榆测表达产物的反应原性.结果:成功克隆了新疆地区奶牛il-6基因,克隆部分编码188个氨基酸与GenBank公布的序列100%同源,表达出46 kDa的融合蛋白,免疫印迹检测显示原核表达牛IL-6有免疫原性.结论:新疆地区奶牛在IL-6的基因序列上与其他地方牛无差异,原核表达奶牛IL-6蛋白为在奶牛乳房炎疫苗中的佐剂效果研究打下了基础.     

鹿茸富脯氨酸多肽-APRP基因融合表达载体的构建及表达

目的:构建鹿茸富脯氨酸多肽(APRP)基因融合表达载体,并诱导表达融合蛋白GST-APRP。方法:以鹿茸顶端组织总c DNA为模板,PCR方法扩增目的片段,连接p MDTM18-T载体,转化E.coli DH5α进行TA克隆。酶切与测序鉴定合格后,将目的片段与p GEX-6P-1质粒连接,完成p GEX-6P-1-APRP融合表达载体的构建。利用原核表达系统进行初步诱导表达。SDS-PAGE蛋白电泳检测蛋白表达情况。结果:PCR成功扩增出目的基因片段,目的基因片段大小为216 bp。提取表达载体质粒经酶切及测序分析证实p GEX-6P-1-APRR融合表达载体构建成功。利用终浓度为0.5 m MIPTG诱导,融合蛋白成功表达,分子量为35 k Da。结论:目前利用基因工程技术获得特定的鹿茸多肽的报道很少。本研究结果表明,利用原核表达系统可在体外对鹿茸富脯氨酸多肽基因(APRP)进行融合表达,并且融合蛋白GST-APRP以可溶形式表达,有利于进一步研究APRP。这也为研究其他鹿茸多肽单体成分提供重要参考。     

番茄内质网ω-3脂肪酸去饱和酶基因原核表达载体的构建与鉴定

通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到内质网ω-3脂肪酸去饱和酶(LeFAD3)基因的部分编码区,该片段cDNA为309 bp,将其克隆到pET-30a(+)载体中,酶切位点分别是BamH I和Sac I,构建了原核表达载体pET-LeFAD3,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,经IPTG诱导蛋白表达,提取蛋白并采用SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况.酶切鉴定结果表明,LeFAD3基因原核表达载体构建成功,目的蛋白成功表达.     

阴道毛滴虫黏附蛋白33基因原核表达载体的构建及表达

目的构建阴道毛滴虫黏附蛋白33基因原核表达载体并诱导其体外表达。方法pMD-18T-ap33重组质粒和pUC18空质粒经BamH Ⅰ和XbaⅠ限制性内切酶双酶切,将ap33基因亚克隆入pUC18载体并进行筛选和鉴定。重组质粒经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳及Western-blot杂交鉴定重组蛋白。结果经双酶切及PCR鉴定,构建的重组质粒为阳性重组子,诱导出的重组蛋白大小约为Mr36000,与理论值基本相符。结论成功构建重组质粒并获得体外表达。     

GST/ AEP 融合蛋白原核表达载体的构建、表达及鉴定

目的：为进一步研究抗癫痫肽（And—epilepsy peptide,AEP）的抗痫机制及筛选其相关作用蛋白,进行GST／AEP融合蛋白原核表达载体的构建及融合蛋白的表达。方法：通过PCR基因扩增对AEP基因进行扩增,并将其克隆于谷胱甘肽-S-转移酶（GST）融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌B121（DE3）,经IPTG诱导获得表达,并采用Western Blot进行检测。结果：成功构建了AEP原核表达载体,并在大肠杆菌B121中获得表达。结论：成功构建了GST／AEP原核表达载体,并表达了GST／AEP融合蛋白。     

抗伏马菌素单链抗体与碱性磷酸酶的融合表达及活性鉴定

为原核表达抗伏马菌素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白并分析其活性,本研究根据抗伏马菌素单链抗体H2的基因序列设计引物,PCR扩增获得目的基因,经限制性核酸内切酶SfiⅠ和Not Ⅰ的酶切位点克隆到pDAP2/S载体中,转化大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株XL1-Blue并鉴定阳性转化子.IPTG诱导H2-AP融合蛋白基因的表达,利用Western blot检测其表达情况,AP显色反应和ELISA鉴定其活性.结果显示成功构建了 pDAP2/S-H2原核表达载体,融合蛋白在大肠杆菌中实现可溶性表达,并保留单链抗体和碱性磷酸酶的活性.因此,H2-AP融合蛋白通过原核表达后可用于发展伏马菌素的快速免疫检测方法.     

HCV包膜蛋白E2的克隆、表达与检测

构建丙型肝炎HCV包膜蛋白糖蛋白的E2基因原核表达载体,获得大量重组HCVE2蛋白,进行E2蛋白的抗原性及潜在保护作用研究。通过RT-PCR从HCVRNA阳性血清标本中扩增出975bp(383～708)E2基因片段,PCR产物经EcoR I和Sall I双酶切后连接到经同样酶切的PET-41a原核表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经Amp筛选,得到阳性重组质粒PET41a-HCVE2菌株,并以IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE鉴定,表达产物经固定化金属配体亲和层析纯化,用ELLSA方法检测生物学活性。结果表明,构建的HCVE2包膜蛋白基因片段原核表达质粒所表达产物主要以包涵体形式存在,表达的融合蛋白与HCV阳性血清具有较好的反应原性。以HCVE2融合蛋白检测患者阳性血清具有良好的抗原性,有望能提高HCV抗体检测试剂盒的检出率。     

马动脉炎病毒核蛋白基因的克隆与表达

马病毒性动脉炎是危害世界养马业的重要传染病之一,是由动脉炎病毒科动脉炎病毒属的马动脉炎病毒(Equinearteritisvirus,EAV)引起的一种以病马发热,步态僵直,躯干及眼周围水肿,并出现粘液脓性鼻炎、结膜炎,外生殖道水肿为特征的传染病,对妊马能引起流产,使易感怀孕母马的流产率     

用E．coli表达Canstatin—N及其表达条件优化

以重组质粒DET—CN为模板设计引物CASN1N和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoRI和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b（＋）载体获得重组表达质粒pET-22b（＋）一CN,转化E．coliBL21（DE3）,用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0．1mmol／L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合hiS6的重组Canstatin—N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成活性。     

幽门螺杆菌VacA重组蛋白表达、纯化及鉴定

目的研究幽门螺杆菌空泡毒素（VacA）编码基因在大肠埃希菌中的表达及纯化重组蛋白的抗原性。方法将PET32a-vacA-E.coli BE21（DE3）工程菌株常规培养,碱裂解法小量提取重组质粒DNA,琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定,基因测序法进行插入基因序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达,镍亲和层析原理提纯,ELISA法检测其抗原性。结果经酶切鉴定表明,插入的基因片段全长约2240bp,测序分析及与Genebank比较,可以肯定插入片段为vacA基因,ELISA法检测重组蛋白具有良好的抗原性。结论VacA重组蛋白在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白具有良好的抗原性。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

APOBEC3G蛋白的原核表达及纯化

目的：原核表达重组APOBEC3G蛋白,为其功能及免疫原性研究奠定基础。方法：提取H9细胞全细胞基因组RNA,通过RT-PCR获得目的基因,经纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,并对表达条件和纯化条件进行优化;利用Western Blot分析鉴定目的蛋白。结果：构建了APOBEC3G蛋白的原核表达载体Apo-His-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性蛋白形式存在;经Ni-NTA亲和层析柱一步纯化,获得了高纯度的重组APOBEC3G蛋白,蛋白浓度可达1．2mg／mL;Westem Blot显示获得了目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达、纯化了可溶性APOBEC3G蛋白,为进一步对其进行免疫原性和功能研究奠定了基础。     

抗AIDS新型导向毒素CVN-LP1融合基因的构建及原核表达

目的：构建重组抗病毒融合蛋白CVN-LP1原核表达载体,并进行表达和鉴定。 方法：将本室已经构建好的pET-CVN和pET-LP1,用EcoRⅠ和HindⅢ同时进行双酶切,将所得的CVN片段连入pET-LP1载体上,构建pET-CVN-LP1表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。用SDS-PAGE,Western-blot等方法分析鉴定表达产物。 结果：重组载体pET-CVN-LP1经PCR和双酶切鉴定,证实构建成功。将其导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物相对分子量为20KD左右,与理论预期值完全相符。凝胶成像分析表明最高表达量可占菌体总蛋白的16.86%。SDS-PAGE、Western-blot分析表明目的蛋白得到了很好的表达。 结论：构建了pET-CVN-LP1原核表达载体,并成功地获得表达,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

人SCYL1-BP1重组蛋白的原核表达及分离纯化鉴定

前期研究结果发现,SCYL1-BP1具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。     

钙激活酶激活蛋白基因的克隆及其在原核生物中表达及条件的优化

构建钙激活酶激活蛋白基因（UK114）的原核表达载体并优化其表达条件,为其高效表达提供试验依据。以UK114 cDNA为模板,通过PCR方法扩增钙激活酶激活蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中,酶切及测序鉴定重组体。将构建好的重组质粒转化大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,在保持菌种不改变的前提下,分别改变IPTG的浓度、培养时间、菌体浓度、培养温度等来优化表达条件。结果显示,原核表达载体pGEX-4T-3-UK114成功构建,可在大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达,得到相对分子质量约40 kD的GST-UK114融合蛋白。在IPTG浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为32℃,诱导时间为4 h,菌体密度OD600为0.6的条件下,目的蛋白表达量最高。试验成功构建原核表达载体pGEX-4T-3-UK114且获高效表达,为研究UK114生物学活性及产品开发提供了试验基础。