稀有密码子影响人RNaseH-Apaf1融合蛋白原核表达

通过限制性内切酶克隆法构建两个pET-28a-TAT-RNaseH-Apaf1重组质粒,其中一个质粒经过稀有密码子的优化。将两个重组质粒分别转化原核表达宿主菌BL21(DE3)和Transetta(DE3),通过SDS-PAGE观察相应融合蛋白诱导表达的情况,并用His标签抗体和Apaf1抗体通过Western Blotting鉴定诱导蛋白。菌液PCR和测序证明经稀有密码子优化和未经稀有密码子优化的人源RNaseH-Apaf1序列成功重组到pET-28a-TAT载体中;经稀有密码子优化的重组质粒成功地在大肠杆菌宿主菌中表达RNaseH-Apaf1融合蛋白,并用Western Blotting检测到该融合蛋白。结果表明,稀有密码子可影响人RNaseH-Apaf1融合蛋白的原核表达。     

重组人磷脂爬行酶1的原核表达及纯化

目的:建立重组人磷脂爬行酶1(hPLSCR1)原核表达及纯化工艺。方法:PCR扩增hPLSCR1编码基因并连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达,Western印迹鉴定所表达蛋白;优化表达条件后,Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:构建了pET-28a-PLSCR1重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量达32%,Ni2+金属螯合法纯化目的蛋白后纯度达到95%以上,Western印迹验证了融合蛋白的特异性。结论:建立了高效稳定的His-PLSCR1表达体系,获得大规模生产His-PLSCR1的分离纯化工艺,为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。     

棉花GhCOMT1基因原核表达载体构建及蛋白纯化和Western鉴定

为进一步研究GhCOMT1基因的功能,构建了原核表达载体pET-28a-GhCOMT1,酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.2mmol/L IPTG浓度条件下分别进行不同温度梯度诱导,用蛋白标记亲和层析柱(His TrapTM HP)对重组蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。结果表明:16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达,其中16℃诱导12h的蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测目的蛋白相对分子量约为39.748kD;Western blotting分析表明,目的蛋白能与His多克隆抗体起特异性反应。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

人PD1胞外须基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的：研究人PD1的生物学活性,制备人PD1胞外段区域及其特异性抗体。方法：用PCR方法扩增编码人PD1胞外段的基因序列（hPD1ecr）,将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,表达蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定。纯化目的蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）,流式细胞术检测抗体滴度及其特异性。结果：原核表达载体pET28a（＋）-PD1ecr成功构建,并可在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,得到的PD1胞外区蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定正确。用纯化蛋白免疫日本大耳白兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论：得到纯化的人PD1胞外蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下人PD1蛋白,为进一步研究PD1功能奠定了实验基础。     

剪接因子1N端1-320氨基酸片段的原核表达及纯化

目的:通过扩增剪接因子1(SF1)的N端1-320氨基酸(aa)片段对应的cDNA,构建His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),在大肠杆菌中诱导表达并进行亲和纯化。方法:PCR扩增SF1的1-320 aa片段对应的cDNA,扩增产物和载体pET-28a(+)经酶切回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,挑取克隆、酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和West-ern印迹分析蛋白表达情况,亲和纯化His-SF1(1-320aa)。结果:SF1片段以正确的读框插入pET-28a(+),IPTG可以诱导大肠杆菌表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western印迹证实得到相对分子质量约为40×103的蛋白,亲和纯化得到高纯度蛋白质。结论:构建了His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),并获得His-SF1(1-320aa)融合蛋白,为进一步研究SF1和U2AF65之间的相互作用及对剪接体形成的影响提供了基础。     

酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-1的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

目的：原核表达和纯化PACS-1,并制备其多克隆抗体。方法：通过RT-PCR扩增出PACS-1的编码基因,测序正确后克隆入原核表达载体pGEX4T-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导PACS-1与GST融合蛋白的表达并经Glutathione Sepharose 4B纯化;经SDS-PAGE和Western blot鉴定,应用纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价。结果：表达和纯化了PACS-1,并获得了较高效价的抗血清。结论：获得纯化的PACS-1及其多克隆抗体,为进一步研究PACS-1的功能奠定了基础。     

Carboxin抗性基因(Cbx~R)原核表达及多克隆抗体的制备

[目的]克隆CbxR基因,进行原核表达,纯化CbxR基因蛋白并制备其多克隆抗体。[方法]CbxR基因克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达并纯化,Western blot鉴定分析。制备CbxR蛋白的兔源多克隆抗体,运用间接ELISA方法检测多抗效价,利用Western blot印记检测抗体特异性。[结果]成功获得CbxR基因,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量表达,成功制备CbxR蛋白兔源多克隆抗体,效价为1∶64 000,经Western blot检测表明多克隆抗体特异性良好。[结论]多克隆抗体为CbxR检测及进一步研究CbxR基因功能奠定了基础。     

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的原核表达及蛋白纯化鉴定

为获得大量高纯度的GhCOMT2蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-GhCOMT2质粒为模板,PCR扩增GhCOMT2基因的cDNA编码区,构建原核表达载体pET-28a-GhCOMT2,经酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,并采用Western blotting方法鉴定表达产物.结果表明:在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达了与标签蛋白融合的GhCOMT2蛋白,大小约为40.062 kD,浓度为0.62 mg/mL.重组蛋白的最佳诱导条件为:0.2 mmol/L IPTG在16℃诱导12 h.重组蛋白以可溶形式高效表达,用蛋白标签亲和层析柱(His TrapTM HP)获得纯化重组蛋白,Western blotting分析表明其能与His多克隆抗体起特异性反应.     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

凋亡素融合蛋白的可溶性表达及活性分析

目的:构建PET-28a-SPA原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现其高效可溶性表达,测定对肿瘤细胞的凋亡效果。方法:本实验在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-28a-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western blot检测,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞的增殖抑制。结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,软件分析表明表达蛋白占菌体蛋白20%左右。上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合,并且对A549肺癌细胞及Hela细胞具有一定的凋亡作用。结论:所获凋亡蛋白以高效胞质可溶形式表达,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。     

OPG-HSP65重组蛋白的原核表达及其生物学活性研究

PCR扩增OPG-HSP65基因,构建原核重组表达载体pET-28a－OPG-HSP65,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达产生包涵体形式的目的蛋白。对重组蛋白进行Western blot检测表明,重组蛋白能与抗His-Tag单克隆抗体及鼠抗人OPG单克隆抗体特异性结合。对重组蛋白进行尿素洗涤纯化,进而透析、复性。经破骨细胞生长抑制实验和抑炎实验表明,重组蛋白能减少破骨细胞生成及减轻迟发型超敏反应小鼠模型炎症反应。     

人免疫缺陷病毒I型Vif蛋白的原核表达、纯化及单克隆抗体制备

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒I型（HIV-1）Vif蛋白,制备其单克隆抗体。方法：提取感染了HIV的细胞基因组DNA,PCR扩增vif基因,插入表达载体pET32a,转化大肠杆菌BL21（DE3）获得工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,Western印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化目的蛋白;免疫BALB／c小鼠,制备单克隆抗体。结果：构建了Vif蛋白的原核表达载体vif-pET32a,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以包涵体形式存在;纯化获得高纯度的重组Vif蛋白,蛋白浓度可达0．56mg／mL;建立了抗Vif蛋白单克隆抗体细胞株,制备了腹水,滴度可达1：16×10^6,抗体纯化后保持了活性和特异性。结论：在原核表达系统中表达、纯化了重组Vif蛋白,制备了针对Vif蛋白的单克隆抗体,为研究Vif蛋白的功能和抗原性奠定了基础。     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体.     

sTACI-Fc-Myc重组质粒的构建、原核表达及活性鉴定

目的:构建s TACI-Fc-Myc重组质粒,并进行原核表达和纯化具有生物活性的融合蛋白。方法:通过PCR法获得s TACI-Fc-Myc重组片段,然后把融合基因片段与原核载体p ET28a连接在一起,并构建p ET28a-s TACI-Fc-Myc重组子,并转入BL21(DE3)中进行表达,用蛋白A凝胶亲和层析柱进行纯化及酶联免疫吸附剂(ELISA)法测定其生物学活性。结果:获得了s TACI-Fc-Myc重组质粒,且该质粒可以在BL21(DE3)中表达,亲和层析柱纯化后纯度可达到95%以上,与BAFF的结合活性具有剂量依赖性,浓度达到5 ng/μL时,两者的吸附达到饱和。结论:成功构建了s TACI-Fc-Myc原核表达载体,并使有生物学活性的融合蛋白在BL21(DE3)上获得了稳定表达,为进一步研究并筛选高活性BAFF拮抗肽奠定了基础。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

HIV-1 Vpu蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的：克隆、表达、纯化人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）Vpu蛋白,为其功能及免疫学研究奠定基础。方法：PCR扩增Vpu基因,纯化、酶切后克隆到原核表达载体pET32a中,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株获得表达工程菌株,IPTG诱导蛋白表达,免疫印迹鉴定目的蛋白,亲和层析纯化蛋白。结果：构建了HIV-1Vpu蛋白的原核表达载体Vpu-pET32a,并在大肠杆菌中高效表达,目的蛋白呈可溶性形式存在,免疫印迹检测显示为目的蛋白,经Ni—NTAAgarose纯化获得了高纯度的目的蛋白。结论：在原核表达系统中表达了可溶性HIV-1Vpu蛋白,为进一步进行HIV-1Vpu蛋白的免疫原性和功能研究奠定了基础。     

人蛋白酶体亚基PSMB1的重组表达、纯化及在蛋白酶体抑制剂体外筛选中的应用

蛋白酶体是真核细胞中的一类多亚基蛋白酶复合物,它在胞内蛋白质降解的泛素-蛋白酶体通路中起关键作用。重组表达蛋白酶体的活性亚基可以用于在体外筛选、寻找具有蛋白酶体抑制剂作用的化合物。将人蛋白酶体催化亚基(PSMB1)cDNA的编码区(全长726 bp)克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组质粒pET28a-PSMB1,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过1 mmol/L IPTG,20℃过夜诱导,获得相对分子量约为27 kDa的重组蛋白,采用IMAC亲和层析柱纯化重组蛋白,纯化后的重组蛋白纯度超过95%。重组蛋白酶解后经NanoLC-MS/MS鉴定表明所表达的融合蛋白氨基酸序列完全正确。在体外BIAcore分析中,重组蛋白表现出对不同化合物的选择性结合能力,其中与蛋白酶体抑制剂雷公藤红素的结合较强,10μmol/L的雷公藤红素与重组蛋白的结合达到27 RU,并且具有良好的浓度依赖型。本研究建立了表达、纯化人蛋白酶体催化亚基PSMB1的方法,并应用于具有蛋白酶体抑制活性化合物的体外筛选。     

C型产气荚膜梭菌β1毒素基因表达

利用PCR技术,从C型产气荚膜梭菌染色体DNA中扩增出β1毒素基因,然后用限制性核酸内切酶BamHI和EcoRI对其进行双酶切处理,回收0．95kb的β1毒素基因片段,最后将其定向克隆在事先经同样内切酶处理的载体pET-28c中相应位点上,转化至受体菌B121(DE3)qh。经BamHI和Eco RI双酶切鉴定和核苷酸序列测定证实,构建的重组质粒pETXBl含有B毒素基因,并且具有正确的基因序列和阅读框架。重组菌株BI21(DE3)(pETXB1)经IPIG诱导后,其表达产物经ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达β1毒素蛋白,该蛋白占菌体总蛋白相对含量的12．24％。