人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质的鉴定及生物信息学分析

糖蛋白质组学方法鉴定人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质,将有助于发现肝癌、慢性肝病相关异常核心岩藻糖基化蛋白质.应用凝集素亲和层析技术、双向电泳(2-DE)联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析,建立人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白表达谱,图谱均点数为(130±3)个,挖取90个蛋白质点进行质谱鉴定,数据库搜索及去冗余后,共鉴定53种蛋白质,主要分布于pI5～9,分子质量为10～100ku区域处.Gene Ontology分类发现它们参与体内代谢等过程,应用NetNGlyc对它们进行糖基化位点预测,并通过蛋白质免疫沉淀联合凝集素亲和印迹对其中的结合珠蛋白前体,α烯醇化酶的核心岩藻糖基化进行了再验证.以上结果提示,凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS/MS分析是一种鉴定某种特定类型糖蛋白的高通量检测方法,所建立的表达谱可用于发现疾病发生、发展中相关的异常核心岩藻糖基化蛋白质.     

人肝癌细胞系的糖蛋白质组学研究

糖基化是最重要的蛋白质翻译后形式之一,糖基化蛋白的糖链部分影响着蛋白质的折叠和稳定性以及其生物学功能.许多恶性肿瘤组织与正常组织相比已显示出蛋白质糖基化的差异.采用蛋白质组学分析方法结合先进的糖蛋白荧光染色技术,研究了正常人肝细胞系(ChangLiver)和人肝癌细胞系(Hep3B)糖蛋白糖基化的差异.首先用细胞裂解法提取细胞总蛋白质,进行双向电泳(2-DE),然后用pro-QEmerald488糖蛋白荧光染料进行糖蛋白染色,得到两种细胞系糖基化蛋白表达谱,经2-DE分析软件Dymension分析2-DE图像,比较糖蛋白的糖基化程度,并对糖基化蛋白进行质谱鉴定.结果显示正常人肝细胞表达(74±2)个(n=3),而人肝癌细胞系表达(78±3)个糖蛋白(n=3).两者匹配的糖蛋白质点31个,Hep3B表达而ChangLiver不表达的糖蛋白质点47个,ChangLiver表达而Hep3B不表达的糖蛋白质点43个.两种细胞系糖基化程度存在明显差异,与正常人肝细胞相比,肝癌细胞发生糖基化改变的糖蛋白有25个,其中糖基化水平上调的有10个,下调的有15个,质谱鉴定出12个发生糖基化改变的糖蛋白.这些结果显示蛋白质糖基化改变可能在肝癌的发生和发展中起一定作用.     

岩藻糖糖链与肝癌细胞的迁移作用

通过凝集素印迹转移电泳和亲和层析技术,对岩藻糖糖基化蛋白在肝癌细胞中的作用进行了研究.在化学诱发的大鼠肝癌过程中, 分子质量在23 ku到40 ku范围内与荆豆凝集素(UEA)及扁豆凝集素(LCA)结合的岩藻糖糖基化蛋白显著减少, 诱癌至17～20周这些条带重新恢复,而分子质量为80 ku的条带却在诱癌过程中逐周增加.比较高、低转移性肝癌细胞的岩藻糖糖基化蛋白, 发现高转移性肝癌细胞具有多种增强的条带.利用橘果粉胞凝集素(AAL)和LCA亲和层析柱分离了这些岩藻糖基化糖蛋白, 并用这些糖蛋白直接作用于肝癌细胞,发现AAL-糖蛋白具有显著抑制肝癌细胞迁移的作用,迁移细胞数从对照的(100±4.9)%下降到(48.1±2.5)% (P＜0.01), LCA-糖蛋白也有类似作用.用胰酶和木瓜蛋白酶水解蛋白质部分后,形成的糖肽抑制肝癌细胞迁移的作用并不改变,甚至增强.此外直接用肝癌转移灶的组织测定了岩藻糖转移酶活性,发现α1,6岩藻糖基转移酶活性显著比正常肝组织高,而α1,3岩藻糖基转移酶活性没有显著的改变.用系列凝集素分析发现这些糖链主要能结合伴刀豆凝集素A, 也能结合E-型及L-型植物凝集素, 显示这种糖蛋白的糖链可能含有较多的高甘露糖型.这些结果提示糖链在诱癌过程中结构有了改变,使之在肝癌细胞的迁移和转移中起重要作用.     

CK8寡糖链结构及翻译水平改变与人肝癌细胞转移相关性研究

糖组学方法筛查人肝癌细胞转移过程中发挥重要作用的核心岩藻糖基化蛋白质分子,解析比较筛出的差异蛋白——细胞角蛋白8(CK8)翻译及糖基化修饰改变与人肝癌细胞转移潜能的关系.应用双向电泳(2-DE)、凝集素亲和印迹、凝集素亲和沉淀联合质谱分析技术,筛查并验证与肝癌转移相关的核心岩藻糖基化蛋白;应用细胞免疫荧光和蛋白质免疫印迹检测CK8的蛋白质表达情况;应用免疫沉淀结合多种凝集素亲和印迹,推测其与肝癌转移相关的寡糖链结构改变.研究发现,3种不同转移潜能人肝癌细胞Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H的扁豆凝集素(LCA)亲和印迹表达谱中,分子质量55～60ku、等电点4～6区域处有核心岩藻糖基化蛋白呈差异表达,质谱鉴定为CK8.LCA亲和沉淀及蛋白质印迹进一步验证CK8异常核心岩藻糖基化与肝癌转移相关;研究发现,CK8分布于细胞浆内,在MHCC97-L和MHCC97-H细胞中蛋白质表达水平较Hep3B高,在MHCC97-H中与LCA和蓖麻凝集素(RCA-1)的亲和力较Hep3B强.以上结果提示,2-DE和凝集素印迹技术联合MALDI-TOF-MS/MS分析可用于筛查疾病过程相关的异常糖基化蛋白质分子,CK8蛋白水平、核心岩藻糖基化及β-1,4末端半乳糖基化的增加均与肝癌细胞转移潜能相关.     

基于凝集素-糖蛋白特异结合的特性筛选与鉴定空肠弯曲杆菌NCTC11168株糖蛋白

[目的]从空肠弯曲杆菌NCTC11168菌株中筛选糖蛋白.[方法]本实验基于凝集素-糖蛋白特异结合的特性,先用免疫印迹的方法确定空肠弯曲杆菌内糖蛋白能与凝集素SBA特异结合,再用包被有凝集素SBA的磁珠捕获样品中的潜在糖蛋白,通过N-乙酰半乳糖胺竞争性洗脱及双向电泳分离,最后利用串联质谱鉴定捕获的糖蛋白.[结果]质谱分析共鉴定到22种空肠弯曲杆菌蛋白,其中至少5种为已报道糖蛋白,包括Cj0633在内的17种为迄今为止未知的潜在糖蛋白.[结论]这种糖蛋白筛选策略可用于细菌糖蛋白的分离鉴定.     

二维电泳和质谱技术鉴定肝癌血清差异表达的N-连接糖蛋白

缺乏有效的早期诊断方法是导致肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)预后极差的主要原因之一.蛋白质异常糖基化与恶性肿瘤细胞侵袭、转移等生物学过程关系密切,人体内至少有50%的蛋白质发生了糖基化修饰.本实验采用IgY12去除血清高丰度蛋白、多植物凝集素亲和层析技术分别从20例肝癌和年龄、性别匹配的20例非癌慢性肝病患者血清中纯化N 连接糖蛋白、二维电泳分析差异表达的蛋白质斑点,质谱检测、生物信息学等技术鉴定了18个差异表达的糖蛋白和/或其异质体（12种高表达和6种低表达）.ExPASy数据库比对结果表明,本实验鉴定的糖蛋白质分子含有至少1个已报道的N 糖基化位点.这些差异表达的糖蛋白属于急性期反应蛋白,分别具有蛋白酶抑制、生物转运、凝血和纤溶等功能,表明肝癌的发生发展过程中机体产生的急性期反应物可能是潜在的肝癌血清标志物.     

用Far-Western印迹技术筛选人肝组织中与乙肝病毒表面抗原PreS1相互作用的蛋白

目的:利用Far-Western印迹技术从正常人肝组织中筛选乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原PreS1结合蛋白,为阐明HBV的感染致病机理提供依据。方法:提取正常人肝组织细胞膜蛋白,双向电泳展示后转膜,对表达纯化获得的PreS1的重要片段与GST的融合蛋白PreS/1-48myr-GST进行Far-Western印迹实验,对筛选获得的蛋白点切胶,质谱鉴定。结果:对PreS/1-48myr-GST融合蛋白进行Far-Western-2D筛选,共获得22个蛋白点,经质谱鉴定获得15个候选相互作用蛋白,其中膜蛋白Ezrin可能在HBV感染致病过程中具有重要作用。结论:Ezrin蛋白能够与乙肝病毒表面抗原PreS1结合,其在HBV感染致病过程中的重要作用值得探索。     

肝癌转移相关的核心岩藻糖基化 蛋白质表达谱的研究

通过比较研究不同转移潜能肝癌细胞系中核心岩藻糖基化蛋白质表达谱的差别,筛查与转移相关的重要糖蛋白 . 用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 、双向电泳 (2-DE) 和凝集素印迹技术联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱 (MALDI-TOF-MS/MS) 分析,建立 3 种不同转移潜能人肝癌细胞系 Hep3B 、 MHCC97L 和 MHCC97H 的核心岩藻糖基化蛋白质表达图谱 . 比较研究发现,不同转移潜能肝癌细胞呈现不同的 SDS-PAGE/LCA 凝集素印迹图谱, MHCC-97H 和 MHCC-97L 在 35~45 ku 和 45~60 ku 间出现了 Hep3B 未见的条带 . 在核心岩藻糖基化蛋白质表达图谱中, Hep3B、 MHCC97L 和 MHCC97H 分别平均检测到 (55±7) 个蛋白质点 (n=3), (60±6) 个蛋白质点 (n=3), (61±4) 个蛋白质点 (n=3);以各自双向电泳图谱为参考胶,Hep3B、 MHCC97L 和 MHCC97H 分别与其匹配的平均匹配点数为 (25±3) 个 (n=3), (30±4) 个 (n=3), (28±3) 个 (n=3). 该图谱中,与 Hep3B 相比, MHCC97L 有 13 个点未匹配,其中 9 个点为 Hep3B( － )/MHCC97L(+); MHCC97H 有 9 个点未匹配,其中 6 个点为 Hep3B( － )/MHCC97H(+), MALDI-TOF-MS/MS 可鉴定出 Annexin1、 Keratin 8 等 12 种差异蛋白质 . 这些结果证实了不同转移潜能的肝癌细胞有明显的核心岩藻基化糖蛋白差异性表达 . 提示肝癌转移可能与这些差异糖蛋白及其核心岩藻糖基化有关 .     

番茄幼苗盐胁迫响应蛋白质组分析

采用营养液栽培,以盐敏感型番茄品种M82为试材,利用双向电泳(2-DE)研究盐胁迫处理下幼苗叶片蛋白质的表达谱,并采用基质辅助激光解析飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术进行差异蛋白质的分离及质谱鉴定。结果表明:(1)盐胁迫处理下,利用2-DE获得差异显著蛋白点20个,其中17个蛋白质点丰度上调表达,3个蛋白质点丰度下调表达。(2)通过质谱分析和蛋白质NCBInr数据库检索,共鉴定出19个差异蛋白,分别为果糖-二磷酸醛缩酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等及3个功能未知蛋白;这些鉴定出的差异蛋白质与能量代谢、光合作用、蛋白合成、氧化还原平衡等过程相关,暗示所分离鉴定的蛋白可能参与了番茄的盐胁迫响应,为进一步研究番茄抗逆机制奠定基础。     

人朊蛋白不同N-糖基化修饰突变体的构建及其在哺乳动物细胞中表达

构建并表达人朊蛋白N-糖基化修饰位点突变的真核表达载体,有助于进一步研究朊蛋白N-糖基化修饰的生物学功能。定点突变野生型人朊蛋白基因PRNP,将获得的突变体亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,并在人宫颈癌细胞株HeLa中瞬时表达各种朊蛋白糖基化修饰位点突变体,利用免疫印迹和糖苷酶消化等糖蛋白分析方法鉴定表达产物的糖基化形式。经Western blot鉴定,野生型和突变型朊蛋白表达产物出现不同形式的泳动特征,分别出现特异性糖基化修饰的多个条带,单糖基化修饰的两条条带和无糖基化修饰的一条条带。经PNGase F糖苷酶消化,野生型和糖基化单点突变型表达产物均能被糖苷酶消化,其分子量下移,去糖基化突变型表达产物的分子条带位置不变。通过突变野生型人朊蛋白基因PRNP的N-糖基化修饰位点,获得单糖基化修饰和去N-糖基化修饰的6种人朊蛋白突变体,并能够在HeLa细胞株中瞬时表达单糖基化修饰和去N-糖基化修饰朊蛋白,为进一步研究朊蛋白的相关功能建立良好基础。     

家蚕半乳糖凝集素BmGalectin-4的表达、纯化及性质分析

【目的】鉴定一种新的家蚕Bombyx mori半乳糖凝集素(galectin)基因,分析其序列和结构特征,测定其在微生物感染后的表达变化,分析其重组表达蛋白与微生物及微生物表面多糖分子的结合特性。【方法】利用TBlastN从家蚕基因组数据库中搜索得到一种新的半乳糖凝集素基因,命名为BmGalectin-4。利用生物信息学分析其序列和结构特征,用半定量RT-PCR检测家蚕分别感染病原菌绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和白色念珠菌Candidiasis albicans后BmGalectin-4在不同组织中的表达变化,采用原核表达技术对该基因进行重组表达,并利用亲和层析得到纯化的蛋白。通过ELISA检测BmGalectin-4与细菌和真菌的结合;通过Western blot检测它与多糖的结合。【结果】序列分析显示,BmGalectin-4是一种串联重复型半乳糖凝集素,含有2个糖识别结构域,其结构非常保守。RT-PCR检测表明,BmGalectin-4在家蚕脂肪体、血细胞和中肠中都有表达,且感染细菌和真菌后其表达有显著变化。纯化的重组BmGalectin-4与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌有较强的结合,与微生物表面多糖的结合试验表明其识别有较高的特异性。【结论】BmGalectin-4 是一个典型的串联重复型半乳糖凝集素,可能参与家蚕对病原微生物的免疫防御反应。本研究为进一步研究昆虫中半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

一个新的前列腺癌细胞系分泌蛋白磷酸甘油酸酯激酶的鉴定与分析

目的：建立前列腺癌细胞系C4-2B分泌蛋白双向电泳图谱,并对感兴趣的蛋白进行质谱鉴定,对其表达调控进行初步分析。方法：收集前列腺癌细胞系C4-2B的分泌蛋白,利用双向电泳结合质谱的方法对感兴趣的蛋白进行鉴定,而后利用Western blot等方法对结果进行验证和分析。结果：得到较为稳定的前列腺癌细胞系分泌蛋白C4-2B双向电泳图谱,鉴定了一个新的前列腺癌细胞系分泌蛋白磷酸甘油酸酯激酶,并发现1nmol/L人工合成雄激素R1881可上调其表达。结论：建立了简便的前列腺癌细胞系分泌蛋白双向电泳及质谱分析的研究方法,初步证明磷酸甘油酸酯激酶是前列腺癌细胞系C4-2B新的分泌蛋白,且人工合成雄激素R1881可诱导其表达上调。     

天麻蛋白质的双向电泳和肽质量指纹谱分析与鉴定

采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱技术对天麻染菌球茎皮层和不染菌的新生球茎皮层进行了比较蛋白质组分析与鉴定。双向电泳后在分子量 1 2～97kD、等电点 3～ 1 0范围内 ,每块胶分离到约 90 0个蛋白质点。对新生球茎中表达量明显增加的 5个蛋白质点用基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱 (MALDI TOFMS)进行肽质量指纹谱的分析 ,并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测 ,初步认为第 4号蛋白点是一个与转录有关的RNA结合蛋白。同时本文在天麻蛋白质组样品制备、数据库检索策略以及蛋白质鉴定成功率等方面进行了探讨。     

糖蛋白质组学的信息学资源和方法

糖基化修饰是生物体内最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰之一.哺乳动物体内超过50%的蛋白质都会发生糖基化修饰.糖蛋白广泛分布于各种组织的细胞膜表面,执行着重要的生物学功能.随着高通量、高灵敏度和高分辨率的蛋白质组学时代的来临,许多基于串级质谱技术解析糖链结构的生物数据库和分析软件也亦应运而生.本文综述了目前文献中最常用的糖类生物信息学资源,包括各种糖蛋白的数据库以及质谱解析糖类的相关工具和新技术、新方法.     

应用优化的双向电泳技术建立纤维堆囊菌So0157-2蛋白质组数据库

堆囊菌丰富的次级代谢产物是新药的重要来源,而蛋白质组学分析是研究代谢调控的有效方法．然而堆囊菌含有大量的胞外多糖以及黏液,干扰了蛋白质组学分析中蛋白质的溶解度、分辨率及重现性．为了高通量地筛选Sorangium cellulosum So0157-2表达的特异性蛋白,实验优化了S. cellulosum So0157-2双向电泳方法．首先,S. cellulosum So0157-2蛋白在裂解液中有更好的溶解度．pH 3～10非线性胶条和1 mg的蛋白上样量适用于第一向等电聚焦,分别提高了蛋白质点的分辨率和低丰度蛋白质的表达．15% SDS-PAGE 改善了S. cellulosum So0157-2蛋白分离的分辨率和重现性．最终,通过优化的双向电泳方法获得了S. cellulosum So0157-2 在M26培养基中培养3天的全蛋白质表达谱,并检测到552个蛋白质点．进而对表达蛋白通过MALDI-TOF-MS进行质谱鉴定,其中474个蛋白质得到鉴定,鉴定率85.9%．得到鉴定的蛋白质包括细胞结构和功能组分,以及细胞代谢合成酶类,其中8个蛋白质与糖类的转化和代谢相关,这有助于糖基化埃博霉素A的深入研究．该优化方法为进一步建立纤维堆囊菌So0157-2在各种培养条件下的蛋白质组表达数据库打下基础．     

成年牦牛与双性牦牛睾丸蛋白质双向电泳的比较研究

为了比较牦牛和双性牦牛睾丸组织中蛋白质的差异表达,以探索双性牦牛生殖障碍的机理。提取牦牛睾丸(n=4)和1头双性牦牛睾丸总蛋白质,采用双向电泳分离后,对差异表达蛋白质点进行质谱鉴定。实验获得了分辨率高、重复性好的牦牛与双性牦牛睾丸组织蛋白质的双向电泳图谱,2倍及以上差异表达的蛋白质24个,其中22个蛋白质经质谱分析和数据库搜索后得到鉴定。有6种蛋白质属于分子伴侣,在双性牦牛睾丸组织中表达量显著下降,推测与双性牦牛精子发生障碍有关。     

Pten^＋/＋MEFs与Pten^-/-MEFs细胞系的差异表达蛋白质组分析

目的：研究PTEN缺失细胞的蛋白表达规律。方法：用双向电泳技术比较Pten^＋/＋MEFs与Pten^-/-EFs细胞的蛋白表达差异;用基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对差异蛋白进行质谱分析;用肽质量指纹图谱检索数据库对差异蛋白进行鉴定;用Northern印迹和Western印迹验证蛋白的差异表达。结果：与Pten^＋/＋MEFs细胞相比。Pten^-/-MEFs细胞有明显的差异性蛋白表达谱,Pten^-/-MEFs细胞中表达下降的蛋白有铜锌超氧化物歧化酶、过氧化物氧化还原酶5和6等,表达增加的蛋白有低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶和丝切蛋白（cofflin）1。结论：PTEN的缺失引起细胞内多种蛋白表达改变,这些表达改变的蛋白可能与PTEN缺失后细胞癌变相关。     

小麦Ven型胞质雄性不育植株与可育植株花药蛋白质组差异研究

普通小麦具有偏凸山羊草（Ae. ventricosa）细胞质的不育系为Ven型胞质雄性不育系（Ven cytoplasmic male sterility, Ven CMS）,是粘类小麦CMS的一种类型。该研究对小麦Ven型雄性不育系冀5418A及其同型保持系冀5419B的单核期和二核期的花药进行差异蛋白质组学分析,探讨小麦质核互作雄性不育的分子机制。通过双向电泳分离花药蛋白,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱（MALDI TOF TOF）对差异表达蛋白进行质谱鉴定,利用生物信息学进行差异表达蛋白鉴定和功能注释分析。结果表明,在分子量19.0～100.0 kD、等电点4～7线性范围内,共检测到约2 000个蛋白点。2个时期共检测到差异蛋白98个,其中两个时期差异表达变化一致的蛋白点56个;数据库搜索获得鉴定的蛋白点41个,其中18个蛋白的表达量在冀5418A 中显著下调,23个在冀5418B 中明显下调。在不育系和可育系中均有参与能量代谢、活性氧代谢、核糖体合成、花粉物质合成的差异蛋白。GO分析预测差异蛋白生物学过程多涉及电子传递和能量代谢、核糖体代谢、活性氧代谢等,细胞组成主要是在膜区域和线粒体,分子功能主要是DNA和RNA结合功能和水解酶等。KEGG分析表明,较多蛋白分布于碳水化合物代谢、活性氧代谢和蛋白组装和折叠途径。推测不育系冀5418A 的雄性不育性除了涉及能量代谢、活性氧清除过程,核糖体蛋白、伴侣蛋白等也有重要作用,雄性不育性可能还与蛋白质加工、物质合成过程的紊乱有关。     

液相色谱-电喷雾质谱法分析牛胰核糖核酸酶B酶解肽谱,糖基化位点及糖型

糖蛋白分析一直是蛋白质分析鉴定的难点, 为建立准确灵敏的糖蛋白分析方法。采用液相色谱电喷雾质谱法（ＬＣＥＳＩＭＳ） 对糖蛋白———牛胰核糖核酸酶Ｂ（ＲＮａｓｅ Ｂ）的酶解肽谱进行分析, 证实其一级结构。通过比较糖苷酶处理酶解肽段前后的肽谱, 确定糖基化位点, 并通过串联质谱（ ＭＳ／ＭＳ） 解析了Ａｓｎ 连接的糖型结构及去糖后肽段的氨基酸序列。糖型结构经α甘露糖苷酶处理和质谱分析确定为高甘露糖型。此外, 还对糖型不均一造成的几种糖肽进行了相对定量。这一方法在ｐｍｏｌ 水平上, 同时分析糖蛋白的一级结构和糖结合位点及糖型, 对含Ｎ糖链的糖蛋白的分析具有普遍意义。     

冠突散囊菌野生型与△veA突变菌株的差异蛋白研究

为了分离和鉴定冠突散囊菌野生型与veA基因缺失菌株的差异表达蛋白,寻找并比较与veA基因相关的产孢蛋白,为进一步研究丝状真菌产孢机理打下基础。经veA基因缺失,利用双向电泳技术分离差异表达蛋白,经凝胶银染显色后,Bio-Rad凝胶扫描仪扫描,Imagemaster图像软件分析,差异蛋白点进行质谱鉴定。所获肽序列与生物信息数据库匹配,在NCBI及Uniprot数据库中查找蛋白质信息,并归纳分析。结果显示,野生型菌株中出现表达上调的蛋白点77个,veA缺失型菌株中出现表达上调的蛋白点有116个,得到鉴定的30个功能各异的蛋白点,其中大多数蛋白与代谢相关。