PC-1增强受体酪氨酸激酶家族成员EphA3在前列腺癌细胞中的转录

为了研究前列腺癌相关基因(prostate and colon gene 1, PC-1）对受体酪氨酸激酶家族分子EphA3表达的影响,用RT-PCR、实时PCR和Western印迹检测表达不同水平PC-1的前列腺癌细胞系LNCaP和C4-2中EphA3的表达情况. 发现PC-1可诱导EphA3基因表达上调. 采用荧光素酶实验检测PC-1对于EphA3启动子转录活性的影响,结果显示,PC-1对转录起始位点上游916 bp的启动子活性没有影响,而可增强转录起始位点上游2011 bp启动子的活性.对EphA3启动子－916 bp～－2　011 bp区域进行生物信息学分析,结果显示,此区域包含HSF、NF-1、Nkx-2、SP1和GATA-1等多种转录因子结合位点.实验结果表明,PC-1可通过影响EphA3启动子诱导EphA3基因高表达,其调控区域位于转录起始位点上游－2　011　bp至－916 bp之间,提示PC-1可能通过影响一些结合于此区域的转录因子来影响EphA3启动子的转录活性.     

Red体内同源重组介导的egfp、kan基因融合和重组质粒构建

重组工程是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,可应用于靶DNA序列的敲入、敲除和基因克隆等。在应用重组工程技术进行基因亚克隆时发现,体外重叠PCR法难以获得高质量的目的DNA打靶片段,严重影响重组效率。为了解决上述问题,根据Red重组酶介导的体内同源重组工作原理进行了技术改进。先用PCR方法合成egfp和kan两条末端互补的线性DNA片段,然后将其电击共转化进入携带Red重组酶和pcDNA3.1载体DNA的大肠杆菌DY331菌株内,经体内同源重组直接产生的pcDNA3.1-egfp-kan环状重组质粒DNA分子可通过抗生素标记筛选获得,阳性率可达到45%,瞬时转染pcDNA3.1-egfp-kan可获得绿色荧光蛋白在293细胞中的表达。     

重组酶Exo、Beta和Gam在大肠杆菌中的表达与纯化

目的:构建exo、beta和gam基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、制备重组酶Exo、Beta和Gam。方法:将exo、beta和gam基因分别构建在原核表达载体pEGKG和pET28a上,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)和DH5α,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中获得可溶性表达蛋白,用柱层析方法纯化蛋白。结果:构建了原核表达质粒pET28a-exo、pET28a-beta、pET28a-gam和pEGKG-exo、pEGKG-beta、pEGKG-gam;SDS-PAGE结果表明重组酶融合蛋白His-Exo、GST-Exo、His-Beta、GST-Beta、His-Gam、GST-Gam得到可溶性表达;用His标签抗体和GST标签抗体通过Western印迹方法检测到纯化后的融合蛋白。结论:在大肠杆菌中诱导表达了λ噬菌体重组酶,并纯化获得了一定量的纯度较好的蛋白,为下一步制备检测用多克隆抗体奠定了基础。     

DH结构域缺失对SGEF在293T细胞中定位的影响

目的:通过构建带EGFP标签的SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体pEGFP-C1-SGEF-△DH并使其在293T细胞表达,观察DH结构域缺失后SGEF在293T细胞中的定位。方法:利用重叠PCR技术在pcDNA3.1-SGEF质粒上扩增缺失DH结构域的SGEF基因,然后将PCR产物亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,对阳性克隆进行双酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染293T细胞,并用Western印迹和细胞免疫荧光技术对重组质粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真核表达质粒构建成功,转染实验发现该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核内。结论:构建了带EGFP标签的人SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞核,为进一步研究SGEF基因DH结构域的细胞生物学功能提供了一个重要的工具。     

PC-1、EphA3和SGEF蛋白表达的相互影响

目的:在293T和LNCaP细胞中验证PC-1、EphA3和SGEF蛋白表达的相互影响。方法 :采用半定量RT-PCR及Western印迹检测EphA3和SGEF在LNCaP细胞中与PC-1的关系,分别在LNCaP和293T细胞中检测EphA3对SGEF表达的影响。结果:在LNCaP细胞中,EphA3和SGEF在RNA及蛋白水平上均受PC-1高表达诱导,而EphA3的高表达对SGEF的表达无明显影响;但在293T细胞中,SGEF受EphA3表达水平的影响,随EphA3表达量的增加而升高。结论:PC-1、EphA3与SGEF蛋白表达的相互影响与细胞类型相关。     

PC-1在前列腺癌细胞系LNCaP中的定位

目的:研究PC-1分子在前列腺癌细胞系LNCaP中的亚细胞定位。方法:利用常规PCR和重叠PCR技术在pEGFP-C1-PC-1上分别扩增PC-1的不同截短体及缺失体基因,PCR产物经酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C1中;经测序确定构建成功的载体在LNCaP细胞中瞬时高表达,在荧光显微镜下观察这些载体表达产物在LNCaP细胞中的定位情况,并通过Western印迹验证这些载体在LNCaP细胞中的表达。结果:构建了多个用于PC-1亚细胞定位研究的、能在LNCaP细胞中表达的载体;同时,还找到了一段对PC-1定位有重要影响的氨基酸序列。结论:为进一步研究PC-1的亚细胞定位及其发挥功能的方式提供了基础。     

敲低前列腺癌相关基因PC-1的表达抑制前列腺癌细胞C4-2雄激素非依赖性生长

目的:研究敲低癌基因D52家族成员PC-1的表达对前列腺癌细胞雄激素非依赖性生长的影响。方法:利用RNA干扰技术构建PC-1稳定低表达的C4-2细胞株;利用四唑盐(MTT)比色实验检测敲低PC-1基因表达对C4-2细胞雄激素非依赖生长的影响。结果:敲低PC-1表达抑制前列腺癌C4-2细胞的生长,并降低了C4-2细胞雄激素非依赖性生长的能力。结论:PC-1基因参与了前列腺癌向雄激素非依赖阶段发展和维持的过程,为进一步研究PC-1在促进前列腺癌细胞发生发展过程中的作用奠定了基础。     

与人PC-1同源的鼠PC-1基因的启动子的分子克隆和特性分析

为了鉴定鼠mPC-1基因表达的调控元件,克隆并分析了该基因的启动子.构建了一系列mPC-1基因启动子的截短序列.通过荧光素酶报道基因,分析了它们在前列腺癌细胞和其它细胞中的表达.结果表明,在AR阳性细胞系中,mPC-1基因启动子活性远远高于SV40和p61-PSA 启动子,mPC-1基因启动子 599 bp 至449bp 可能含有一个负调控元件; mPC-1 1.1 kb 启动子控制的表达主要在前列腺癌细胞系中; 雄激素可调控mPC-1 1.1kb 启动子表达.mPC-1 1.1kb 序列是一个有前列腺癌细胞特异性和较强的启动子,经过进一步的修饰有可能作为一种有用的前列腺癌基因治疗元件.     

重组酶Exo的纯化及多克隆抗体制备

目的:纯化Exo重组酶融合蛋白并制备相应抗体。方法:用阴离子交换柱对蛋白进行初步纯化,然后用Ni-NTA介质填充的层析柱分离纯化含His标签的融合蛋白,用谷胱甘肽琼脂糖4B介质填充的层析柱分离纯化GST融合蛋白;二次纯化的蛋白利用硝酸纤维素膜结合法制备抗原蛋白并免疫实验动物。结果:ELISA结果显示血清抗体效价可达到1∶12 800,说明通过Western免疫印迹自制的多克隆抗体能特异地与Exo重组蛋白相互作用。结论:该蛋白纯化方法操作简单,制备的抗原纯度高,多克隆抗体特异性好。     

EphA3受体截短突变体variant b在前列腺癌细胞中的分泌表达

目的:验证EphA3受体截短突变体variant b是否是一种分泌蛋白,并探索其内源分泌的特点,在细胞水平看其是否有作为前列腺癌血清标志物的潜质。方法:构建EphA3 variant b真核表达载体,应用标签抗体、特异性抗体和Western印迹检测前列腺癌细胞培养液中EphA3 variant b的表达,用RT-PCR方法分析EphA3 variant b在8种细胞系中的表达谱和对雄激素刺激的应答。结果:验证了EphA3 variant b是一种分泌蛋白,在雄激素受体阳性的前列腺癌细胞系中特异性表达,雄激素以剂量依赖方式诱导EphA3 variant b表达。结论:EphA3 variant b是一种分泌蛋白,其表达与雄激素受体信号通路相关,有作为前列腺癌血清标志物的潜质。