转移潜能不同人肝癌细胞系差异蛋白Annexin1的功能解析

解析比较蛋白质组学筛出的差异蛋白Annexin1的生物学功能,证实其是否在肝癌转移复发中发挥作用. 分别以RT-PCR、蛋白质印迹及细胞免疫化学对差异蛋白Annexin1在转移潜能不同人肝癌细胞系中的表达情况进行再验证,然后构建Annexin1反义表达质粒,转染高转移潜能人肝癌细胞系MHCC97H,通过对MHCC97H细胞的运动、侵袭、凋亡、生长周期、MMPs分泌、克隆形成等系列检测,观察目的蛋白表达降低对其生物学行为的影响,特别是转移特性的影响. 验证结果均证实Annexin1在有转移潜能人肝癌细胞系MHCC97L、MHCC97H中呈高表达. 转染Annexin1反义重组表达质粒后,MHCC97H细胞中Annexin1的表达被成功抑制. 依据MHCC97H/pcDNA3.1(+) AS Annexin1,MHCC97H/ pcDNA3.1(+),MHCC97H的检测排序,转染反义重组质粒后的MHCC97H细胞穿过上室底膜的细胞数 (运动实验) 分别为：11.13±3.31,18.88±2.03,21.86±3.38;穿过人工基底膜细胞数 (侵袭实验) 分别是：16.43±2.23,16.40±1.57,16.86±1.52;细胞平均集落形成率 (克隆形成实验) 分别为：(14.33±0.46)%,(19.35±0.49)%,(20.25±0.35)%;MHCC97H细胞凋亡比例 (FCM分析) 依次为22.2%,6.44%,6.97%;细胞周期各时相的比例依次为：G0-G1期79.5%/76.34%/80.5%,S期13.26%/14.4%/9.69% ,G2-M期7.25%/9.26%/9.81%;细胞培养上清MMP9的定量结果依次为：26.37 μg/L,28.00 μg/L,31.90 μg/L;MMP2定量结果依次为29.46 μg/L,26.37 μg/L,26.53 μg/L. 明胶酶谱分析细胞培养上清显示,转染Annexin1反义重组表达质粒的MHCC97H细胞分泌的MMP9活性与对照比变化不明显. 综合上述结果发现,转染Annexin1反义表达质粒MHCC97H细胞运动能力及集落形成率明显降低,凋亡细胞的比例增加,而侵袭潜能,细胞周期时相,细胞分泌MMP2、MMP9的量均变化不明显. 提示,差异蛋白Annexin1可能通过影响细胞凋亡和细胞运动在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥作用.     

人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质的鉴定及生物信息学分析

糖蛋白质组学方法鉴定人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质,将有助于发现肝癌、慢性肝病相关异常核心岩藻糖基化蛋白质.应用凝集素亲和层析技术、双向电泳(2-DE)联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析,建立人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白表达谱,图谱均点数为(130±3)个,挖取90个蛋白质点进行质谱鉴定,数据库搜索及去冗余后,共鉴定53种蛋白质,主要分布于pI5～9,分子质量为10～100ku区域处.Gene Ontology分类发现它们参与体内代谢等过程,应用NetNGlyc对它们进行糖基化位点预测,并通过蛋白质免疫沉淀联合凝集素亲和印迹对其中的结合珠蛋白前体,α烯醇化酶的核心岩藻糖基化进行了再验证.以上结果提示,凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS/MS分析是一种鉴定某种特定类型糖蛋白的高通量检测方法,所建立的表达谱可用于发现疾病发生、发展中相关的异常核心岩藻糖基化蛋白质.     

基于凝集素芯片的不同转移潜能肝癌细胞膜蛋白糖谱比较

评估采用凝集素芯片技术寻找肝癌细胞表面侵袭和转移相关特征性糖谱的适用性．首先选取一对模式细胞株(中华仓鼠卵巢细胞CHO和其N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ缺陷株Lec1)验证凝集素芯片系统的可靠性．然后通过凝集素芯片比较正常肝细胞L02、非转移肝癌细胞Hep3B、高转移肝癌细胞HCCLM3的细胞表面糖谱,同时采用细胞凝集素组织化学的方法验证芯片结果．细胞Hep3B和L02相比,对凝集素PHA-L、ConA、AAL、MPL的亲和作用增强而对凝集素WGA的亲和作用减弱,提示在肝癌细胞表面可能出现了增多的复杂寡糖分支、高甘露糖、末端岩藻糖、黏蛋白T抗原和减少的N-乙酰葡萄糖胺和/或多价唾液酸结构．细胞HCCLM3和Hep3B相比,对凝集素LCA、MAL-Ⅰ、MAL-Ⅱ、WGA、PHA-E的亲和作用增强而对凝集素RCA-I的亲和作用减弱,提示在高转移肝癌细胞HCCLM3的表面可能出现了增多的核心岩藻糖、唾液酸(主要是α2-3链接方式)、N-乙酰葡萄糖胺、平分型GlcNAc结构以及减少的末端β1-4链接半乳糖结构．细胞凝集素组织化学的结果支持芯片结果．研究证明,凝集素芯片技术是解析生物学进程中糖谱改变的适用工具．     

转移性人肝癌类组织体模型的建立

为了探讨三维培养状态下人肝癌细胞的生物学特征和转移潜能,利用旋转壁式生物反应器(rotating wall vessel, RWV)结合生物支架材料,将高转移性人肝癌细胞(MHCC97H)成功地构建成一种新的转移性人肝癌类组织体模型,针对肝癌细胞的临床病理特征,一系列体外和体内实验包括组织形态、显微结构、蛋白质产生和分泌、葡萄糖代谢、组织特征基因表达、细胞的生长和凋亡,以及在裸鼠中的成瘤性和转移性等对模型进行检测评估,结果均显示,该模型能较好地模拟转移性人肝癌组织的病理特征,且优于单层培养的人肝癌细胞,该模型可能对肝癌转移分子机制探讨、抗癌药物筛选以及肝癌动物模型建立产生积极的推动,同时也表明肝细胞癌(HCC)细胞的立体形态结构对维持肝癌细胞生物学功能十分重要．     

人肝癌细胞系的糖蛋白质组学研究

糖基化是最重要的蛋白质翻译后形式之一,糖基化蛋白的糖链部分影响着蛋白质的折叠和稳定性以及其生物学功能.许多恶性肿瘤组织与正常组织相比已显示出蛋白质糖基化的差异.采用蛋白质组学分析方法结合先进的糖蛋白荧光染色技术,研究了正常人肝细胞系(ChangLiver)和人肝癌细胞系(Hep3B)糖蛋白糖基化的差异.首先用细胞裂解法提取细胞总蛋白质,进行双向电泳(2-DE),然后用pro-QEmerald488糖蛋白荧光染料进行糖蛋白染色,得到两种细胞系糖基化蛋白表达谱,经2-DE分析软件Dymension分析2-DE图像,比较糖蛋白的糖基化程度,并对糖基化蛋白进行质谱鉴定.结果显示正常人肝细胞表达(74±2)个(n=3),而人肝癌细胞系表达(78±3)个糖蛋白(n=3).两者匹配的糖蛋白质点31个,Hep3B表达而ChangLiver不表达的糖蛋白质点47个,ChangLiver表达而Hep3B不表达的糖蛋白质点43个.两种细胞系糖基化程度存在明显差异,与正常人肝细胞相比,肝癌细胞发生糖基化改变的糖蛋白有25个,其中糖基化水平上调的有10个,下调的有15个,质谱鉴定出12个发生糖基化改变的糖蛋白.这些结果显示蛋白质糖基化改变可能在肝癌的发生和发展中起一定作用.     

肝癌转移相关的核心岩藻糖基化 蛋白质表达谱的研究

通过比较研究不同转移潜能肝癌细胞系中核心岩藻糖基化蛋白质表达谱的差别,筛查与转移相关的重要糖蛋白 . 用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 、双向电泳 (2-DE) 和凝集素印迹技术联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱 (MALDI-TOF-MS/MS) 分析,建立 3 种不同转移潜能人肝癌细胞系 Hep3B 、 MHCC97L 和 MHCC97H 的核心岩藻糖基化蛋白质表达图谱 . 比较研究发现,不同转移潜能肝癌细胞呈现不同的 SDS-PAGE/LCA 凝集素印迹图谱, MHCC-97H 和 MHCC-97L 在 35~45 ku 和 45~60 ku 间出现了 Hep3B 未见的条带 . 在核心岩藻糖基化蛋白质表达图谱中, Hep3B、 MHCC97L 和 MHCC97H 分别平均检测到 (55±7) 个蛋白质点 (n=3), (60±6) 个蛋白质点 (n=3), (61±4) 个蛋白质点 (n=3);以各自双向电泳图谱为参考胶,Hep3B、 MHCC97L 和 MHCC97H 分别与其匹配的平均匹配点数为 (25±3) 个 (n=3), (30±4) 个 (n=3), (28±3) 个 (n=3). 该图谱中,与 Hep3B 相比, MHCC97L 有 13 个点未匹配,其中 9 个点为 Hep3B( － )/MHCC97L(+); MHCC97H 有 9 个点未匹配,其中 6 个点为 Hep3B( － )/MHCC97H(+), MALDI-TOF-MS/MS 可鉴定出 Annexin1、 Keratin 8 等 12 种差异蛋白质 . 这些结果证实了不同转移潜能的肝癌细胞有明显的核心岩藻基化糖蛋白差异性表达 . 提示肝癌转移可能与这些差异糖蛋白及其核心岩藻糖基化有关 .