激素和活性多肽

<正> 853295编码人的类前胰岛素原生长因子的一个cDNA克隆序列[英]/Bell,G.I.…//Nature.-1984,310(5980).-775～777[译自D B A,1984,3(21),84-10026]类胰岛素生长因子(促生长因子,IGF)-特异性克隆是通过分子杂交从一成人     

胭脂鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）cDNA的分子克隆、序列分析及组织表达

参考多种生物的胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因序列,设计并合成引物。用胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)肝总RNA逆转录得到cDNA并扩增获得特异性片段,回收纯化后亚克隆到pMD-18T载体上。测序后经序列比对分析表明,所得到的序列是胭脂鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA片段,共489bp,包括该基因完整的开放阅读框(ORF)486bp,编码162个氨基酸。氨基酸序列与其他鲤形目鱼类具有较高的同源性,对胭脂鱼IGF-Ⅰ在一些组织中的表达研究发现,IGF-Ⅰ在肝中表达最多,其次是胰、性腺,在脑、垂体、鳃、心、脾中也有不同程度的表达,而在肠、肾、肌肉中的表达不十分明显。     

团头鲂胰岛素样生长因子-Ⅰ基因克隆与分析

胰岛素样生长因子－Ⅰ（IGF－Ⅰ）是一单链多肽。在脊椎动物中,IGF－Ⅰ通过介导生长激素达到促进生长的作用。为研究鲤科鱼类IGF－Ⅰ的结构功能及在水产养殖中的潜在应用前景,采用逆转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）方法,从团头鲂（Megalobrama amblycephala）肝脏的总RNA中扩增出IGF－Ⅰ cDNA。测定了该基因序列,推导其编码的蛋白质序列,克隆的cDNA序列编码包括信号肽和B、C、A、D、E6个区域的161个氨基酸。E区域分析结果表明所克隆的团头鲂IGF－Ⅰ序列属于IGF－ⅠEa-2亚型。     

草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

 为构建草鱼 (Ctenopharyngodonidellus )胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )大肠杆菌表达质粒 ,对已克隆到的草鱼IGF Ⅰ基因进行改造 .改造后的基因去除了原cDNA的信号肽和E区序列 ,并在基因的两端分别加入起始密码子和终止密码子 .将改造后的编码草鱼IGF Ⅰ成熟肽基因亚克隆到pBV 2 2 0中 ,构建成表达质粒pBVgIGF7.转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)进行表达 .SDS PAGE显示 ,含重组表达质粒的菌株经热诱导后表达出一约 7 5kD的特异蛋白 .表达量占菌体总蛋白的2 0 0 3% ,表达产物主要以包涵体形式存在 .重组蛋白经纯化和复性后 ,采用MTT法测定其对草鱼吻端成纤维细胞PSF和草鱼卵巢细胞CO的促增殖作用 .结果表明 ,所获得的重组草鱼IGF Ⅰ具有生物活性     

草鱼IGF—Ⅰ cDNA的克隆和在原核生物中的表达

根据亲缘关系较近的鲤鱼胰素样生长因子－Ⅰ（IGF－Ⅰ）cDNA设计一对引物,通过RT－PCR从草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肝组织首次克隆了草鱼IGF－ⅠcDNA开放阅读框（ORF）片段,经序列分析表明克隆的草鱼IGF－ⅠcDNA为Ea－2亚型,ORF与鲤鱼有95％的同源性,与人有63％的同源性;草鱼IGF－Ⅰ蛋白与鲤鱼IGF－Ⅰ仅2个氨基酸残基不同,与人IGF－Ⅰ也仅有13个残基不同,将表达成熟草鱼IGF－Ⅰ(gcIGF-Ⅰ）蛋白的cDNA片段亚克隆至谷胱甘肽S－转移酶（GST）融合表达载体pGEX－4T－3,再将构建的重组表达载体pGEX-T-gcIGF-Ⅰ转入大肠杆菌BL21。在IPTG的诱导下,GST－gcIGF-Ⅰ融合蛋白高效表达。兔抗鲑鱼IGF－Ⅰ抗血清进行了Western Blot检测显示重组草鱼IGF－Ⅰ蛋白具有免疫活性。     

草地藏系绵羊IGF-Ⅰ基因的克隆及序列分析

采用Trizol法从草地藏系绵羊肝脏中提取总RNA,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增并克隆测序,获得长度为589 bp的胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)cDNA序列,共编码70个氨基酸的成熟肽.分析显示,草地藏系绵羊与其他绵羊IGF-Ⅰ的cDNA编码区序列存在1个碱基差异,同源性达99.78%.     

密斑刺鲀igf2基因的克隆及表达分析

胰岛素样生长因子2 (insuline-like growth factors 2,IGF2)在控制脊椎动物的生长、发育、繁殖、代谢和渗透调节等方面发挥着关键作用.本研究利用分子克隆技术分离并鉴定了密斑刺鲀(Diodon hystrix) igf2基因cDNA序列738 bp,其中开放阅读框全长645 bp,可编码214个氨基酸残基.多重序列比对分析发现,密斑刺鲀IGF2氨基酸序列与其他鱼类的IGF2具有较高的同源性,显示出序列进化的保守性.组织分布结果表明,igf2基因在肝脏和脑组织中表达量较高,而在肾脏以及精巢中没有检测到表达信号,表明igf2基因具有显著的组织表达特异性.本研究结果为深入研究密斑刺鲀的igf2基因在生长发育中的调控机理提供研究基础.     

天祝白牦牛IGF-2基因的cDNA克隆

旨在克隆天祝白牦牛胰岛素样生长因子2(IGF-2)基因编码区全长cDNA序列,为研究该基因的生理功能奠定基础。运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列。扩增获得天祝白牦牛IGF-2基因全长cDNA序列为1 060 bp(GenBank登录号:KF682139),ORF长540 bp,编码179个氨基酸。其编码的氨基酸与已报道哺乳动物IGF-2氨基酸序列同源性在80%-92%之间。天祝白牦牛IGF-2基因的成功克隆为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

大黄鱼PPAR β全长cDNA的克隆和组织表达

利用RT-PCR和SMART RACE的方法从大黄鱼肝脏中克隆了PPARβ全长cDNA。该序列长3390bp,5′端非翻译区146bp,3′端非翻译区1711bp,开放阅读框1533bp,可编码一个由510个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质分子量为57.2kDa、等电点为6.46。氨基酸序列分析表明,PPARβ基因具有较高的保守性,大黄鱼PPARβ与花鲈、金头鲷、欧鲽、大西洋鲑、红鳍东方鲀、人、黑猩猩、牛、兔及小鼠等10个物种的同源性为72%~91%,其中与花鲈同源性最高,为91%。用RT-PCR法检测PPARβ基因的组织表达,结果表明该基因在大黄鱼肌肉、眼、脾、肾、肝、鳃、心、肠和脑等9个组织中均有表达,其中肝脏组织表达量最大,肌肉最少。     

胰岛素样生长因子1(IGF-1)mRNA同源模板竞争性PCR定量方法的建立

胰岛素样生长因子 1(IGF 1)是一种多功能的细胞增殖调控因子 ,其表达水平受多种因素的影响 ,为了研究IGF 1基因在转录水平上的调控机制 ,建立了定量测定IGF 1mRNA的竞争性PCR方法 .同时 ,也建立了一种简便的制备同源性竞争模板的方法 .以构建好的重组pUC IGF 1质粒为基础 ,利用IGF 1mRNA序列上唯一存在 ,但是在pUC18质粒上多拷贝的MspⅠ酶切位点 ,以该限制性内切酶处理重组pUC IGF 1质粒 .在T4DNA连接酶作用下对酶切产物进行随机连接 ,以连接产物作为模板 ,用可扩增IGF 1cDNA的引物进行PCR ,由此得到因含有随机插入序列而与原IGF 1cDNA产生明显长度差别的重组IGF 1.以不同浓度的该DNA片段作为同源竞争模板与大鼠肝组织cDNA在同一反应体系中进行PCR ,对PCR产物进行分析 ,计算出样本中IGF 1cDNA的初始浓度 .成功地建立了IGF 1mRNA的竞争性PCR定量检测方法 ,为研究IGF 1基因的表达调控奠定了基础 ,同时也为对已克隆的基因进行mRNA定量测定提供了一种简便和灵敏的手段     

草鱼CYP1A和ACT基因cDNA片段的克隆与鉴定

以Trizol法分别提取BNF诱导和对照处理草鱼的肝组织总RNA并合成cDNA第一链,以此为模板利用1对ACT特异性引物和(8条)6对CYP1A简并引物进行扩增。结果显示,引物对F0-R0在对照和诱导草鱼中均扩增得到预期ACTcDNA片段,而引物对F4-R4在诱导草鱼中获得预期CYP1A cDNA产物。这两个cDNA片段分别进行克隆、测序和比对,BLAST结果表明草鱼ACTcDNA片段(800 bp)与GenBank中ACT基因(登录号M25013)同源性为99.1%,推导氨基酸序列同源性为99.2%;草鱼CYP1A cDNA片段(439 bp)与鲤鱼同源性最高,为92.5%,推导氨基酸同源性为96.6%。上述序列提交GenBank,获得登录号分别为DQ211096和DQ211095。通过Mega 3.1软件的Neighbor-joining程序对CYP基因的部分cDNA序列和氨基酸序列进行比对分析并绘制进化树,根据CYP1A部分蛋白的系统发育关系,在进化上可以将参与比对的真骨鱼划分为4个主要的分支。     

鲢鱼、鳙鱼、草鱼谷胱甘肽过氧化物酶cDNA的克隆及肝组织表达

利用RT-PCR技术分别从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)及草食性鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idella)肝组织扩增出谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)cDNA核心序列。序列分析表明鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX的cDNA序列均为263bp,编码87个氨基酸。鲢鱼、鳙鱼、草鱼与斑马鱼(Danio rerio)(同属鲤科)、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(鲈形目)等鱼类GPX氨基酸序列同源性很高,为75%～93%;与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)等哺乳动物GPX氨基酸序列的同源性也较高,为76%～79%。以β-肌动蛋白为内参照,比较鲢鱼、鳙鱼、草鱼肝组织GPX cDNA的表达水平,鲢鱼、鳙鱼肝组织GPX的表达量远高于草鱼肝的GPX表达量,这与鲢鱼、鳙鱼大量摄入微囊藻毒素在鱼体内引发产生过量的脂过氧化物相适应。     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF164)基因并分析其基本表达模式。采用RT-PCR技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用半定量RT-PCR方法进行组织表达检测。获得了内蒙古白绒山羊VEGF164基因编码区cDNA全长序列,扩增片段全长573 bp,包含了完整的ORF,编码190个氨基酸残基。核苷酸序列与绵羊的VEGF164(EU857623.1)基因同源性为99%,相应的氨基酸序列同源性为99%。SMART程序分析表明,ORF编码的蛋白质具有信号肽序列及血小板衍生和血管内皮生长因子家族(PDGF,VEGF)结构域。Psite程序分析表明,有1个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶磷酸化位点。ProtComp Version 9.0程序分析将其定位于细胞外。RT-PCR检测表明,VEGF164基因在绒山羊脑、心脏、睾丸、胰腺、脾、肾和肺组织中均有表达。     

草地藏系绵羊IGF-I基因的克隆及序列分析

采用Trizol法从草地藏系绵羊肝脏中提取总RNA,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行cDNA扩增并克隆测序,获得长度为589bp的胰岛素样生长因子(IGF-I)cDNA序列,共编码70个氨基酸的成熟肽。分析显示,草地藏系绵羊与其他绵羊IGF-I的cDNA编码区序列存在1个碱基差异,同源性达99.78%。     

水貂IGF-Ⅰ基因的克隆、序列分析及原核表达分析

获得水貂IGF-Ⅰ基因的cDNA序列,实现IGF-Ⅰ基因在大肠杆菌中的融合表达。利用RT-PCR技术从水貂肝脏组织扩增出水貂胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）的编码区序列。此序列编码153个氨基酸的前体蛋白质。同源性分析表明IGF-Ⅰ的核苷酸和氨基酸序列与已报道的金丝猴、小熊猫、大熊猫、东北虎、马等哺乳动物的序列高度同源（＞90%）。对位比较发现水貂的信号肽序列具有氨基酸特异性,这些氨基酸是否影响水貂IGF-Ⅰ分子的构型、进而影响功能则需要进一步的研究。将构建的重组表达载体pGEX-6P-1-IGF-Ⅰ转入大肠杆菌BL21进行原核表达,得到高效融合表达,融合蛋白分子量约为34 KD。Western-blotting杂交证实了表达蛋白的抗原活性。本研究成功克隆、表达了水貂IGF-Ⅰ基因,分析和预测了其结构和功能,为进一步的生物活性研究打下基础。     

鲫两种不同生长激素cDNA的分子克隆和分析

从鲫脑垂体组织提取总RNA ,采用 3′RACE PCR的方法 ,从单一垂体总RNA中扩增出编码两种不同类型鲫生长激素的cDNA :生长激素Ⅰ (GrowthhormoneⅠ ,GHⅠ )和生长激素Ⅱ (GrowthhormoneⅡ ,GHⅡ )。将两种类型的鲫GHcDNA分别克隆到pGEM TEasyVector上进行序列测定和分析。克隆的鲫GHⅠ和GHⅡcDNA均包括编码 188个氨基酸残基的GH成熟肽序列和 3′端的非翻译区 ,但不含信号肽序列和 5′端非编码区。序列分析结果表明 ,鲫GHⅠ的碱基序列和推测的氨基酸序列与国外已经发表的金鱼GHⅠ的同源性分别为 98 7%和 97 9% ;GHⅡ的碱基序列和推测的氨基酸序列与金鱼GHⅡ的同源性分别为 99 1%和 99 5% ,虽然同源性较高 ,但仍具有一定的差异     

小鼠Mterf2基因cDNA的克隆、序列分析与组织表达特征

目的:克隆BALB/c小鼠线粒体转录终止因子2(Mterf2)基因cDNA编码区序列,分析Mterf2 mRNA和蛋白质在小鼠大脑、心、脾、肺、肾、肝、胰腺、肌肉和睾丸等9种组织中的表达情况。方法:以BALB/c小鼠肝组织总RNA为模板,RT-PCR扩增Mterf2基因cDNA编码区序列,将其克隆至pMD-19T载体,通过菌落PCR、双酶切和DNA序列测定进行验证;采用MEGA 6.0软件构建Mterf2基因系统发生树;通过Northern印迹和qRT-PCR方法检测Mterf2基因mRNA在小鼠各组织中的表达量;通过Western印迹检测MTERF2蛋白在小鼠多个组织中的表达量。结果:克隆获得BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA的编码区序列,其全长1158 bp,编码385个氨基酸残基,克隆到的序列与GenBank参考序列的同源性为100%,无任何碱基突变和移码突变。小鼠Mterf2基因与大鼠Mterf2基因的同源性最高,达到91.0%,在系统发生树上聚类为一簇。Mterf2基因mRNA和蛋白质在BALB/c小鼠心、脑、肝和肾等新陈代谢旺盛的组织中表达丰度最高,其次是在胰腺、睾丸和肌肉组织,而在脾和肺组织中表达相对较低。结论:克隆了BALB/c小鼠Mterf2基因cDNA的编码区序列,并进行了多种组织的表达特征分析,为后续研究Mterf2基因在实验动物体内的生理功能奠定了基础。     

内蒙古白绒山羊IGF-IR基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊IGF-IR基因并分析其基本表达模式.采用RT-PCR克隆基因,将得到的IGF-IR基因cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析.半定量RT-PCR进行组织特异性表达检测.获得了内蒙古白绒山羊IGF-IR基因3’端编码区2118 bp的cDNA序列(JN200823),编码705个氨基酸残基.核苷酸序列与牛的IGF-IR( XM606794.3)基因同源性为98％,相应的氨基酸序列同源性为99％.SMART分析表明,推导出的编码蛋白具有跨膜域,酪氨酸激酶催化域.半定量RT-PCR检测表明,IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达.     

能源植物续随子延伸因子EF1A基因cDNA序列的克隆及分析

利用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆得到能源植物续随子延伸因子EFIA基因的cDNA序列(命名为ElEF1A,GenBank登录号为KT892703)。序列分析表明,ElEF1A编码序列(CDS)长1344bp,编码447个氨基酸,氨基酸序列具有典型的EF1-alpha、EF1-alpha-Ⅱ和EF1-alpha-Ⅲ结构域。ElEF1A与其他植物EF1A基因的核苷酸序列同源性达到88%以上,推导的氨基酸序列的同源性达95%以上。     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白