内蒙古白绒山羊TSC2基因克隆与表达模式分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊TSC2基因cDNA并分析其特性及基本表达模式.利用RT-PCR分段克隆TSC2基因cDNA片段并测序,将得到的cDNA各片段核苷酸序列拼接后获得绒山羊TSC2基因编码区全长序列(HQ684023)并进行生物信息学分析.半定量RT-PCR方法检测TSC2基因在不同组织中的表达特异性.结果表明内蒙古白绒山羊TSC2基因cDNA编码区核苷酸序列为5184 bp,包含了编码1727个氨基酸残基的全长ORF.核苷酸序列与牛、猪、马、大熊猫、犬、恒河猴、人、小鼠及大鼠的同源性分别为97％、90％、89％、88％、87％、87％、87％、86％和86％.NCBI CDD程序预测该基因编码的蛋白质有一个Tuberin结构域和一个Rap-GAP结构域;Psite程序分析有5个N糖基化位点、2个cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点、16个蛋白激酶C磷酸化位点、25个酪蛋白激酶磷酸化位点.PSORT程序预测其定位于胞内体膜.TSC2基因在内蒙古白绒山羊的睾丸、脑、肝脏、肺、乳腺、脾和肾脏等组织中都有表达,mRNA丰度在睾丸中较高,乳腺中较低.     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF164)基因并分析其基本表达模式。采用RT-PCR技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用半定量RT-PCR方法进行组织表达检测。获得了内蒙古白绒山羊VEGF164基因编码区cDNA全长序列,扩增片段全长573 bp,包含了完整的ORF,编码190个氨基酸残基。核苷酸序列与绵羊的VEGF164(EU857623.1)基因同源性为99%,相应的氨基酸序列同源性为99%。SMART程序分析表明,ORF编码的蛋白质具有信号肽序列及血小板衍生和血管内皮生长因子家族(PDGF,VEGF)结构域。Psite程序分析表明,有1个蛋白激酶C磷酸化位点,4个酪蛋白激酶磷酸化位点。ProtComp Version 9.0程序分析将其定位于细胞外。RT-PCR检测表明,VEGF164基因在绒山羊脑、心脏、睾丸、胰腺、脾、肾和肺组织中均有表达。     

内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因克隆及组织表达特性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)基因并分析其表达模式。采用RT-PCR技术扩增TCTP基因编码区cDNA序列,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用定量RT-PCR方法检测TCTP基因在绒山羊不同组织中的表达特异性。获得的内蒙古白绒山羊TCTP基因编码区cDNA序列全长519 bp,包含了完整的ORF,编码172个氨基酸残基组成的蛋白质。核苷酸序列与绵羊、牛、猪、人、猴及大鼠的同源性在99%-95%之间。生物信息学分析表明,编码的蛋白质理论分子质量19.6 kD,等电点(pI)4.673,含有一个N端糖基化位点,一个蛋白激酶C磷酸化位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,定位于细胞质中。定量RT-PCR方法检测表明,TCTP基因在绒山羊肾脏、肌肉、胰腺、肝脏、睾丸和脑组织中均有表达,其中在肝脏中的表达量较高,在脑中表达量较低。     

内蒙古白绒山羊erk2基因的克隆及表达模式分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊erk2基因cDNA并分析其基本表达模式。采用RT-PCR方法克隆白绒山羊erk2基因cDNA。通过在线软件Blast进行核酸序列分析,用SMART与Psite进行氨基酸序列分析。定量RT-PCR检测erk2基因在绒山羊组织中的表达特异性。免疫组化法检测绒山羊睾丸中erk2表达。克隆到的内蒙古白绒山羊erk2基因cDNA片段 (GenBank Accession No.JX569765) 长1 083 bp,包含了编码360个氨基酸残基的全长ORF,氨基酸序列与牛的ERK2 (Bos Taurus BC133588.1) 同源性为100％。SMART分析表明,ORF编码的蛋白包含了活化位点“TEY”及具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化活性的S-TKc结构域。Psite分析表明,含2个N-糖基化位点、1个依赖于cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化位点、3个蛋白激酶c磷酸化位点、5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N-豆蔻酰化位点、2个异戊二烯基结合区 (CAAX box)、7个微体羧基端靶向信号、2个蛋白激酶ATP结合区标记及一个丝/苏氨酸蛋白激酶活性区域标记。PSORT (k-NN prediction) 程序预测其定位于细胞质中。定量RT-PCR分析显示erk2基因mRNA丰度在心脏、皮肤以及乳腺组织中mRNA丰度较高,脾、肾中的表达相对较低。在睾丸中检测到ERK2蛋白表达。     

内蒙古白绒山羊4E-BP1基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊4E-BP1(真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1)基因并进行生物信息学及表达模式分析。根据已报道物种4E-BP1基因cDNA序列,用primer premier5软件设计引物,通过RT-PCR从绒山羊胎儿成纤维细胞总RNA中扩增出4E-BP1基因编码区cDNA序列,对目的片段进行测序及表达模式分析。克隆到的内蒙古白绒山羊4E-BP1基因cDNA全长357 bp,包含了完整的的ORF,编码118个氨基酸残基。核酸序列与牛、马、人、大鼠及小鼠的同源性分别为98%、90%、90%、88%和87%。4E-BP1基因在绒山羊脑、心脏、睾丸及胰腺组织中均有表达。     

阿尔巴斯白绒山羊KAP6家族cDNA的特征分析

在构建内蒙古阿尔巴斯白绒山羊次级毛囊兴盛期皮肤组织cDNA文库的基础上,随机挑取636个克隆从5’端开始测序,对序列进行特征分析。分析结果表明有41个ESTs与绵羊KAP6-1基因同源性大于95％,且期望值小于1e-10,进一步分析可被分为6个Qusters。从每个Cluster中挑取一个全长cDNA序列,其核苷酸序列和预测编码的蛋白质序列表明AY310753与绵羊KAP6-1最为相似、AY310750差别最大,AY310751和AY310752在编码区分别缺少36个的核苷酸或12个的氨基酸。     

悬钩子属植物肌动蛋白基因片段的克隆与表达

目的:克隆悬钩子属植物肌动蛋白基因(actin),为研究该物种中其他基因的表达和调控提供内标基因.方法:利用一对特异性引物从黑莓、悬钩子杂种和树莓品种中克隆actin cDNA片段,对其进行序列分析和半定量RT-PCR表达分析.结果:从3个品种中均获得一条783 bp actin cDNA片段,编码260个氨基酸,3条actin片段与其他植物核苷酸序列的同源性都在82%以上,与其他植物氨基酸序列同源性也均在95%以上;树莓和悬钩子杂种品种的actin核苷酸和氨基酸序列同源性均达99%,系统进化分析也发现两者亲缘关系较近些;表达分析发现actin基因在各品种不同组织中均有一定的表达量.结论:首次克隆了悬钩子属植物肌动蛋白基因actin,将来自黑莓和树莓品种的序列登录在GenBank,登录号分别为HQ439556和HQ439557.     

葡萄果实(E)-β-丁香烯合酶基因的克隆及其表达分析

利用生物信息学方法,通过电子克隆获得葡萄(Vitis vinifera Linn.) (E)-β-丁香烯合酶基因的cDNA序列;以从葡萄品种‘德引84-1’(‘Deyin 84-1’)果肉中提取的mRNA为cDNA模板,利用特异PCR技术克隆得到1个全长1 880 bp的基因,被命名为Vv-ECar(GenBank登录号JF808010),该基因序列包括开放阅读框1 674 bp、3’非翻译编码区209 bp和poly+ (A) 28 bp,可编码557个氨基酸.比对结果显示:葡萄Vv-ECar基因的核苷酸序列与葡萄VvGwECar2基因的同源性达93％,二者编码的氨基酸序列同源性达90.8％,均含有植物萜类合酶家族共有的保守域DDXXD;葡萄Vv-ECar与茶[Camellia sinensis (Linn.)0.Kuntze]和杨(Populus balsamifera subsp.trichocarpa×P.deltoids)的萜类合酶相关基因同源性均在73％以上;分子进化树的分析结果也显示葡萄Vv-ECar基因编码的氨基酸序列与其他植物的同源序列具有高度保守性.半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析结果显示:在葡萄果实发育的不同阶段均有Vv-ECar基因的表达,但其相对表达量随果实的发育呈先低后高的趋势,其中在幼果期相对表达量最高.     

家鸽Caveolin-1基因全长cDNA的克隆、序列和组织表达分析

窖蛋白(Caveolin)是一类构成细胞膜上胞膜窖主要结构的标志蛋白,由Caveolin基因家族编码而成。Caveolin-1基因是Caveolin基因家族的成员之一。该实验采用RT-PCR与RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术成功地克隆了家鸽Caveolin-1基因的全长cDNA。该cDNA全长2605bp,包含537bp的完整编码区,编码178个氨基酸;分析发现家鸽Caveolin-1基因编码区与牛、家犬、鸡、褐家鼠等核苷酸同源性为80.1%～93.4%,氨基酸同源性高达85.4%～97.2%;半定量RT-PCR分析表明该基因在家鸽各种组织广泛表达,脂肪中表达量最高,各种肌肉中表达量次之,肝脏中表达量最低。此结果说明家鸽Caveolin-1基因可能与脂肪、肌肉中的某些代谢途径有关。     

猪骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因的cDNA克隆与表达分析

从人骨骼肌快肌肌钙蛋白C2（TNNC2）基因出发,在dbEST数据库中进行同源性搜索,找到一个有较高同源性且在猪背最长肌中表达EST（BM083186）。通过电子克隆和进一步RT-PCR实验验证,获得猪TNNC2基因全长cDNA序列,其全长843bp,开放阅读框为201～683bp,编码有160个氨基酸。同源性分析结果表明,与人、鼠的骨骼肌快肌肌钙蛋白C2基因cDNA编码区（CDS）同源性分别为93.6％、90.5％,蛋白序列同源性均为97.5%。多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在骨骼肌中表达,并且在杜洛克猪背最长肌中的表达比兰塘猪高。     

甜菜坏死黄脉病毒75kDa通读蛋白基因54kDa片段的克隆及其序列分析

以甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)内蒙分离物的总RNA为模板,通过反转录和PcR扩增获得75kDa通读蛋白基因54kDa片段的目的片段。将其克隆到pGEM－7Zf(+)上并转化DH5α得到了含有完整s4kDa片段的重组子pGBW52。采用双脱氧终止法进行序列分析。结果表明内蒙分离物的54kDa片段全长为1509nt,与法国的F13分离物相比缺失了3个核苷酸。其核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列的同源性分别为94．97％和96．42％．     

番杏Actin基因片段的克隆及生物信息学分析

本实验为研究番杏(Tetragonia tetragonioides)功能基因表达模式提供内参基因,根据登录在NCBI上植物的Actin基因的保守区域设计简并性引物,通过RT-PCR克隆获得番杏的Actin基因片段,将该片段连接于载体pGEM-T后进行测序,并将该基因序列通过生物信息学软件进行分析。结果显示,克隆所得基因片段大小为598 bp,编码198个氨基酸;该序列与登录在NCBI上的其他植物的Actin基因的核苷酸序列的同源性最大可达86%以上,编码蛋白的氨基酸序列同源性在88%以上。结果表明,本研究克隆所得的基因序列为番杏Actin基因片段。该基因命名为TtActin1,在Gen Bank的登录号为MH33308。     

青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHARdehydroascorbatereductase基因的cDNA与DNA全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导PCR的染色体步行技术(genomewalking)克隆了其上游644bp的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长1486bp,存在两个内含子,DNA编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明BoDHAR与同源基因AT1G19570.1cDNA序列有82.3%的一致性,推导的氨基酸序列有79.6%的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明BoDHAR在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。     

人骨髓基质细胞中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶DcDNA的克隆

为探讨人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)cDNA的结构及功能 ,应用RT PCR从人骨髓基质细胞中克隆了长约 2 6kb的GPI PLDcDNA ,包含完整阅读框架 ,编码 2 3个氨基酸的信号肽及 817个氨基酸的成熟肽 .该cDNA与人胰腺GPI PLDcDNA几乎百分之百同源 ,与人肝脏GPI PLDcDNA同源性为 95 %,氨基酸同源性为 94 %,3者对应的结构基因只有 1个 ,位于人类第 6号染色体上 ,基因组序列长约 80kb ,包括 2 5个外显子 .构建克隆的GPI PLDcDNA的真核表达载体 ,通过脂质体转染能表达GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶 (PLAP)而无GPI PLD活性的G9细胞 ,同时设立对照组检测GPI PLDcDNA的功能 .结果显示 ,对照组细胞几乎检测不到GPI PLD活性 ,其表达的PLAP主要位于细胞膜上 ;而转染GPI PLDcDNA的G9细胞能检测到较高水平的GPI PLD活性 ,而且大部分酶活性存在于培养液中 ,其表达的PLAP也主要被释放入培养液 .结果证实 ,从人骨髓基质细胞中克隆的GPI PLDcDNA有生物学功能 ,它能释放细胞膜上GPI锚定蛋白质 .     

棉铃虫HaTO-like基因的克隆、序列分析和表达特征

【目的】克隆和分析了棉铃虫Helicoverpa armigera HaTO-like基因的编码框序列,检测了该基因的时空表达谱以及在棉铃虫感染核型多角体病毒HaSNPV后的转录变化,为深入研究该基因的功能提供理论依据。【方法】本研究利用RT-PCR的方法首次克隆获得HaTO-like基因的全长cDNA序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析,并利用荧光定量PCR技术检测了该基因在棉铃虫不同发育阶段、幼虫组织和成虫组织的表达情况,以及HaSNPV感染对HaTO-like基因表达的影响。【结果】棉铃虫HaTO-like基因cDNA全长为994 bp,开放阅读框为756 bp,编码251个氨基酸,其蛋白序列的N端含有23个氨基酸的信号肽。进一步的序列分析表明棉铃虫HaTO-like与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不是太高,大概在39%~61%之间,其中与家蚕和脐橙螟在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果表明该基因在棉铃虫的5龄0 h和成虫第1天的的表达量相对较高,在幼虫的头部和表皮内的表达量较其他幼虫组织较高,在成虫的头部和足的表达量也相对较高。而病毒感染则显著地诱导了该基因在棉铃虫幼虫头部和表皮内的表达。【讨论】本研究克隆了棉铃虫HaTO-like基因的全长cDNA序列,分析了该基因的序列特征和表达谱,为进一步阐释该基因的功能奠定理论基础。