Ascl2、Nap1l4和Osbpl5基因在牛胎盘中的表达分析

基因组印记是一个复杂的表观遗传修饰过程,从而使印记基因呈单基因表达的模式。大部分的印记基因在动物的胎盘中表达,通过调节胎盘的生长和转运能力而促进妊娠和胎儿发育。CDKN1C/KCNQ1OT1印记区域与人类的BWS综合症以及肿瘤的发生有关。Ascl2、Nap1l4和Osbpl5是位于CDKN1C/KCNQ1OT1印记区域的3个基因,其在小鼠和人胎盘中的表达存在差异,在小鼠的胎盘中3个基因是印记的,而在人中为非印记。本研究利用基于单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism, SNP)的RT-PCR产物直接测序法分析了Ascl2、Nap1l4和Osbpl5在牛的胎盘中表达状态,结果发现Ascl2、Nap1l4和Osbpl5基因在牛的胎盘中的表达与人相似,是双等位基因表达,说明Ascl2、Nap1l4和Osbpl5在胎盘中印记表达模式具有物种特异性。     

栽培草莓潜在印记基因FaTRG-31的克隆与特征分析北大核心CSCD

在前期通过筛选获得草莓候选印记基因FaTRG-31(turgor-responsive protein 31)的基础上,以八倍体栽培草莓‘红颜’(Fragaria×ananassa Duch.‘Benihoppe’)为材料,对FaTRG-31基因的编码序列进行克隆、生物信息学、组织表达、启动子和印记特性分析,以揭示该基因的作用机理,为草莓印记基因表达调控及生物学功能研究奠定基础。结果显示:(1)草莓FaTRG-31基因开放阅读框(ORF)全长999 bp,编码332个氨基酸,含有典型的Asn-Pro-Ala(NPA)基序和6个跨膜结构,定位于细胞质膜,属于典型的AQP蛋白(aquaporin)家族;系统进化树深入分析表明FaTRG-31为PIPs(plasma intrinsic proteins)亚家族1型蛋白。(2)草莓FaTRG-31在不同组织中均有表达,胚乳中的表达量最高,且在FaTRG-31基因上游克隆出的1989 bp启动子序列中发现含有与胚乳特异表达相关的作用元件,此外还有多种非生物胁迫响应元件和激素响应元件等。(3)草莓印记特性分析结果显示,FaTRG-31在胚乳中的SNP(single nucleotide polymorphism)位点处测序峰为单峰且是母本表达,即该基因在栽培草莓胚乳中为母本表达印记基因。(4)非生物胁迫处理后分析发现,草莓FaTRG-31基因能在不同程度上响应非生物胁迫。     

文蛤HDAC1基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探索HDAC1基因在文蛤生长发育中的作用, 研究通过已构建的文蛤转录组文库, 利用SMARTRACE技术扩增得到文蛤HDAC1 (Mm-HDAC1)基因的cDNA全长序列, 分析了其生物信息学、组织及发育阶段表达特征, 并用直接测序法在外显子中筛查生长相关的SNP位点。结果显示, Mm-HDAC1基因的cDNA全长3065 bp, 开放阅读框1599 bp, 编码532个氨基酸; 氨基酸序列比对发现, 文蛤与其他物种同源性为74.3%78.7%。荧光定量PCR (qRT-PCR)结果表明, Mm-HDAC1基因在文蛤6个组织中均有表达, 其中外套膜中的表达量相对最高, 并与其他组织间有极显著差异(P0.01); 不同发育时期的表达差异结果表明, Mm-HDAC1基因在壳顶幼虫期表达量最高, 显著高于其他发育时期(P0.05)。SNP位点筛查结果表明, 在Mm-HDAC1基因的外显子区域发现了19个SNP位点, 其中有3个SNP位点(627AT、924TC和1266TC)与文蛤生长相关。     

牛FSHR基因第10外显子单核苷酸多态性及其与双胎性状的关系

以秦川牛和荷斯坦奶牛的双胎母牛和单胎母牛为实验材料 ,以牛的FSHR基因的第 10个外显子作为标记牛双胎性状的候选基因 ,用SNP法进行了多态检测 .结果发现 ,在秦川牛的双胎母牛中突变率 6 0 % (6 10 ) ,而在单胎母牛中突变率为 2 0 % (2 10 ) ;在荷斯坦奶牛中 ,双胎母牛突变率为31 2 5 % (5 16 ) ,单胎母牛突变率为 6 6 7% (1 15 ) ;由此可见双胎牛和单胎牛二者之间FSHR基因的第 10个外显子的突变率差异明显 .这表明 ,选择FSHR基因的第 10个外显子有可能作为双胎性状的候选基因 .序列分析发现 ,在FSHR基因的第 15 0 6位碱基发生了突变 (T→C) ,但氨基酸没有发生变化 .     

GTL2基因在体细胞核移植牛中的印记状态分析

体细胞核移植技术（SCNT）在医学研究、畜牧业生产和拯救濒危动物方面有重要的应用价值,而核移植效率低是制约其应用的主要因素．印记基因在哺乳动物胚胎发育和出生后的正常生长中都具有十分重要的作用,GTL2基因是在人和鼠中已被鉴定的印记基因,它作为一种RNA调解分子调控目的mRNA的转录．为了研究GTL2基因在自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的印记状态,首先应用PCR-SSCP方法对GTL2基因多态性进行检测,鉴定自然繁殖牛和体细胞核移植牛中的杂合子,进而利用RT-PCR-SSCP技术对GTL2基因在杂合子牛的心、肝、脾、肺、肾、大脑中的表达状态进行分析．研究结果表明：GTL2基因在自然繁殖牛的被检测的6个组织中均表现为单等位基因表达,在体细胞核移植牛的心和肝中表现为单等位基因表达,而在大脑、脾、肺、肾中为双等位基因表达,GTL2基因在体细胞核移植牛的部分组织中表达紊乱有可能是造成体细胞核移植牛器官发育异常和核移植效率低下的原因之一．     

基于DNA池测序法筛选奶牛高信息量SNP标记的可行性

首先选择139个牛SNP标记, 利用DNA池测序法, 根据测序峰图中不同碱基信号峰高的比值确定了92个SNP为高信息量标记(比值>1/2); 为了进一步验证筛选的准确性, 对其中59个标记采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术检测了122头荷斯坦牛的基因型。结果显示, 检出率高于85%的标记有56个, 其平均最小等位基因频率(Minor allele frequency, MAF)为0.41, 最小值为0.27, 最大值为0.5; MAF>0.3的标记有54个, 占96.4%(54/56)。文章结果表明, 采用DNA池测序法筛选高信息量SNP标记是可行和可信的。     

重组鲁西黄牛α干扰素融合蛋白的表达及其抗病毒活性研究

通过PCR从鲁西黄牛(Yellowcattle)基因组DNA中克隆了α干扰素(BoIFN-α)基因,并插入到pET32a 中,构建成重组原核表达质粒pET32a /BoIFN-α,进行测序和诱导表达。测序结果表明,鲁西黄牛IFN-α基因全长498个核苷酸,含一个开放阅读框(ORF),编码166个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。表达产物经SDS-PAGE分析,表达出40kD的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%。表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化,纯化产物进行复性后在MDBK/VSV上的活性为5×105u/mg。重组牛IFN-α(rBoIFN-α)对牛轮状病毒(BRV)有一定的抑制作用,抗BRV病毒活性为1.5×105u/mg。结果显示从鲁西黄牛中克隆了IFN-α基因的一种新亚型,即BoIFN-αC2,并实现了高效表达,获得了具有较高抗病毒活性的重组干扰素产物,为重组牛干扰素的开发奠定了基础。     

牛黑素皮质素受体1(MCIR)基因与毛色表型的研究

牛MC1R基因不仅与毛色有关,而且与牛乳中乳蛋白的含量有关。利用PCR-RFLP和DNA测序技术分析了中国荷斯坦黑白花牛,中国荷斯坦红白花牛,鲁西黄牛和渤海黑牛共4个品种的MC1R基因。共检测出3种等位基因(ED,E ,e)。中国荷斯坦黑白花牛主要是ED和E 等位基因(ED=0.12、E =0.80);渤海黑牛也主要是ED和E 等位基因(ED=0.52、E =0.47);中国荷斯坦红白花牛和鲁西黄牛大多为e等位基因(e=0.95)。中国荷斯坦红白花牛和鲁西黄牛还存在E /e基因型。由此推测ED和E 等位基因导致黑色素合成。另外发现牛MC1R基因编码区725处存在一重要的SNP(单核苷酸多态性)。     

非编码RNA与哺乳动物基因组印记的起源

基因组印记是由亲本来源不同而导致等位基因表达差异的一种遗传现象,主要发生在胎盘哺乳动物（真哺乳类）和显花植物中.大部分印记基因都分布在印记基因簇内,其中包含大量的非编码RNA基因.印记基因的表达受印记控制区（ICRs）的顺式调控.基因组印记产生的原因及过程是现代遗传学研究的一个热点问题,分析印记同源区从非印记物种到印记物种的过渡,为解决这一问题提供了重要启示.最近,原始哺乳动物（有袋类和单孔类）模式物种全基因组测序的完成,极大地促进了印记同源区的比较分析研究.本文对这些研究进行了回顾和分析,发现非编码RNA与哺乳动物基因组印记获得关系密切.主要依据为：（1）伴随着基因组印记的获得,印记区有大量的非编码RNA新基因出现;（2）与基因组印记相关的一些保守非编码RNA的表达发生了显著变化.此外,对15种脊椎动物中印记snoRNA基因系统分析的结果表明：印记snoRNA起源于真哺乳类与有袋类动物分化之后,并且在真哺乳类辐射进化之前发生了迅速的扩张,主要的基因家族在这一时期已经形成.这些结果进一步证明了非编码RNA与基因组印记获得的密切联系.非编码RNA可能主要通过调控印记表达和诱导染色体表观遗传修饰两种机制,参与哺乳动物基因组印记的获得.     

柴达木黄牛Y-SNPs遗传多样性、群体遗传结构及父系起源

为从分子水平上探究柴达木黄牛的父系遗传多样性、群体遗传结构及起源,本研究利用PCR产物直接测序和生物信息学方法对62头柴达木黄牛公牛2个Y染色体标记(即UTY-19和ZFY-10)进行多态性检测分析,结果表明:柴达木黄牛在2个Y染色体标记上均具有多态性,其中UTY-19标记检测到1个CA核苷酸颠换,而ZFY-10标记未发现SNP位点,但发现存在1个GT核苷酸插入/缺失。依据2个标记核苷酸变异确定单倍型组,结果显示柴达木黄牛包含Y1和Y2两种普通牛单倍型组,所占频率分别为0.21和0.79,提示该品种有2个普通牛父系起源。单倍型多样度为0.336 9±0.060 5,提示柴达木黄牛具有较低的父系遗传多样性。     

牛黑素皮质素受体1(MC1R)基因与毛色表形的研究

牛MC1R基因不仅与毛色有关, 而且与牛乳中乳蛋白的含量有关。利用PCR-RFLP和DNA测序技术分析了中国荷斯坦黑白花牛, 中国荷斯坦红白花牛, 鲁西黄牛和渤海黑牛共4个品种的MC1R基因。共检测出3种等位基因(E^D, E⁺, e)。中国荷斯坦黑白花牛主要是E^D和E⁺等位基因(E^D=0.12、E⁴=0.80); 渤海黑牛也主要是E^D和E⁺等位基因(E^D=0.52、E⁺=0.47); 中国荷斯坦红白花牛和鲁西黄牛大多为e等位基因(e=0.95)。中国荷斯坦红白花牛和鲁西黄牛还存在E⁺/e基因型。由此推测E^D和E⁺等位基因导致黑色素合成。另外发现牛MC1R基因编码区725处存在一重要的SNP(单核苷酸多态性)。     

FGF5基因对内蒙古绒山羊绒毛性状的影响

根据FGF5基因已知DNA序列设计了2对引物, 采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术, 在内蒙古绒山羊群体中进行基因多态性检测, 结果发现FGF5基因外显子1存在限制性内切酶BglⅠ多态位点。对其不同基因型个体PCR回收产物进行测序, 测序结果发现该SNP是由碱基序列C→T的突变而引起的。基因型和基因频率统计, 该实验群体以等位基因A具有明显的优势, χ2检验表明该SNP位点的基因频率处于Hardy-Weinberg平衡状态; 对该SNP与绒毛性状关联分析, 表明该SNP对绒纤维伸直长度(P<0.01)和含绒量(P<0.05)有显著影响, 而对其他各绒毛性状的影响不显著(P>0.05)。AB基因型个体绒纤维伸直长度(P<0.01)和含绒量(P<0.05)显著高于AA基因型个体。     

PON基因簇序列变异筛查研究

摘要：系统筛查PON1、PON2及PON3基因编码、剪接及侧翼序列,以期发现所有潜在功能多态基因座,为进一步探讨PON基因家族与心血管疾病的关系做准备。随机选择48例冠心病患者作为筛查对象, 以PCR产物直接测序检测DNA序列变异。扩增片断涵盖整个外显子, 其两侧部分内含子区域及5’和3’侧翼序列。（1）13.9kb测序范围内共发现31个多态性基因座,均为单核甘酸多态（SNP）,其中17个SNP为首次报道。（2）国人中SNP构成和等位基因频率与高加索人群存在显著差异。（3）一个基因内部两个或多个多态性基因座间存在完全或近乎完全连锁不平衡相当常见。中国汉族人群中PON基因簇多个潜在功能多态基因座的识别及这些基因座间的强连锁不平衡状态,为在国人中探讨PON基因簇与心血管疾病关系提供了重要的基础数据。     

SARS冠状病毒S蛋白候选细胞受体氨基肽酶N的基因变异研究

氨基肽酶N是人类冠状病毒HCoV 2 2 9E的细胞受体 ,可能为SARS冠状病毒 (SARS CoV)S蛋白的受体。应用变性高效液相色谱 (DHPLC)技术筛查了正常无关个体中氨基肽酶N编码基因ANPEP的全部外显子及其两侧部分内含子序列。对筛查中DHPLC峰型提示有基因变异存在的DNA片段行PCR产物直接测序 ,共发现 9种单核苷酸多态 (SNP) ,其中 4种为非同义SNP ,分别为T32 1M(96 2C >T)、S6 5 1L(195 2C >T)、S75 2N(2 2 5 5G >A)和G76 4R(2 2 90G >A) ;其余 5种SNP为T795T(2 385C >T)、IVS7+17G >A、IVS14 16A >G、IVS17+12C >G和IVS17+44C >T。这些SNP的发现 ,为SARS CoV的宿主遗传因素研究 ,特别是发现SARS CoV感染和SARS发病的易感基因或抗病基因 ,提供了遗传标记。     

牦牛MEF2C基因克隆、生物信息学及表达谱分析

本试验旨在分析牦牛(Bos grunniens)肌细胞增强因子2C(myocyte enhancer factor 2C,MEF2C)基因的分子特征和表达规律,探索其影响牦牛肌肉发育的作用机制.试验以大通牦牛肌肉组织cDNA为模板,采用PCR扩增技术扩增牦牛MEF2C基因,用DNAStar,ExPASy,ABCpred等生物信息学软件分析MEF2C基因序列和其编码的蛋白质结构,利用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测了 MEF2C基因的表达情况.试验克隆获得的牦牛MEF2C基因编码区全长1 302 bp,编码433个氨基酸;蛋白质结构预测结果显示,MEF2C蛋白具有30h的半衰期,为亲水性碱性蛋白,没有信号肽但拥有跨膜结构.系统关系中牦牛与普通牛的亲缘关系最为接近,与小鼠亲缘关系较远.组织表达谱结果显示,MEF2C基因在牦牛7个组织中都有表达且在臀二头肌组织中表达量最高;不同时期MEF2C基因表达情况为胎牛＞成年牛＞6月龄牛.研究结果将为进一步探讨MEF2C基因在牦牛肌肉发育中的作用提供科学依据,同时也为解析牦牛肌肉发育的分子机制提供数据支撑.     

血管内皮生长因子基因3''UTR 不同基因型载体的构建与鉴定

目的:构建含SNP位点的血管内皮生长因子(VEGF)基因3’UTR的荧光素酶报告基因载体,为进一步揭示VEGF基因3’UTR的单核苷酸多态性(SNP)影响肺癌发病风险的分子机制奠定基础。方法:以rs3025039和rs3025040两个位点均为C纯合子的非癌症病人血液DNA为模板,扩增出两位点为C/C单体型、长度为1448 bp的VEGF基因3’UTR目的片段,测序验证后将其克隆至pMIR-REPORT荧光素酶报告基因载体上,得到重组质粒pMIR-C/C。同时,我们以pMIR-C/C为模板定点突变两个SNP位点,得到具有T/T单体型的重组质粒pMIR-T/T。将各重组质粒转化大肠杆菌DH10B,筛选阳性克隆后提取质粒进行双酶切鉴定及DNA测序鉴定。结果:单菌落质粒测序验证显示带有C/C单体型的VEGF基因3’UTR重组质粒pMIR-C/C构建成功;经两次定点突变,成功将pMIR-C/C质粒转变为pMIR-T/T,经测序验证未引入任何其他突变。同时生物信息学预测还显示rs3025040位点位于miR-199a/b与VEGF基因mRNA的结合位置,其改变可以影响miRNA与mRNA的结合效率。结论:本研究成功构建了含有两个连锁SNP的VEGF基因3’UTR的荧光素酶报告基因载体,为今后VEGF基因3’UTR的功能研究奠定基础。     

文蛤Smad1/5基因克隆、时空表达及生长相关SNP位点筛查

为探讨Smad1/5基因在贝类生长发育中的调控作用, 利用RACE技术克隆获得文蛤Smad1/5(Mm-Smad1/5)基因的cDNA全长序列, 对其生物信息学、不同组织和不同发育时期时空表达特征进行分析, 并利用直接测序法分析了外显子区域SNP位点与生长性状的相关性。结果表明: Mm-Smad1/5的cDNA全长序列为1832 bp, 开放阅读框1380 bp, 编码459个氨基酸; 氨基酸多序列比对显示, Mm-Smad1/5蛋白与太平洋牡蛎Smad5、大西洋舟螺Smad1的一致性分别为83.7%和80.2%, 与人、鸡、非洲爪蟾等脊椎动物Smad1、Smad5氨基酸序列的一致性达到70.5%以上, 说明该基因具有较高的保守性; 结构域预测发现, Mm-Smad1/5含有Smads蛋白家族特有MH1、MH2两个高度保守结构域。荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明, Mm-Smad1/5基因在成体6个组织均有表达, 尤其在斧足、外套膜中表达量显著高于其他组织(P<0.05);Mm-Smad1/5基因在各发育时期广泛表达, 从原肠胚期开始大量表达, 一直持续到壳顶幼虫期, 而从眼点幼虫大量下降, 稚贝时期又有所上升。Mm-Smad1/5基因外显子区域SNP位点相关分析表明, 共发现了9个SNP位点, 其中936 G>T位点与文蛤的生长性状显著相关(P<0.05)。Mm-Smad1/5基因在文蛤生长发育中发挥重要调控作用, 可作为高产良种选育的候选基因, 而生长关联SNP位点分析将为文蛤分子标记辅助育种研究奠定重要基础。     

猪PEG1基因多态性及其遗传印记

PEG1基因影响动物胚胎生长及母性行为,多数动物PEG1为父方表达的遗传印记特征,但出生后猪的PEG1印记表达尚不清楚。因此,文章选取长白、大白和蓝塘3个品种共166头纯种猪,在猪的PEG1基因外显子12区域内寻找SNP,采用PCR-SSCP方法对其多态性进行检测和基因频率分析;取带有PEG1基因该位点SNP为杂合的仔猪3头,对其胃、胸腺、胰、脾、肺、肌肉、肝、舌、肾、脑、膀胱、心脏等组织器官和胎盘的mRNA产物分别进行RT-PCR-SSCP分析,结果表明:PEG1基因外显子12存在一个由G突变为A的单核苷酸多态性位点;PEG1的外显子12在3头仔猪的主要组织器官仅表达父亲来源的等位基因,表明猪的PEG1基因呈母方印记、父方表达的遗传特征。     

小麦RING型E3泛素连接酶基因TaSDIR1-D克隆与功能分析

具有RING结构域的E3泛素连接酶SDIR1(Salt-and drought induced really interesting new gene finger1)在植物信号调节通路中发挥着重要的作用。本研究克隆得到小麦TaSDIR1-D基因,基因组序列全长4070 bp,其中编码区上游为1443 bp,编码区为2352 bp,3'端非编码区(UTR)为275 bp;该基因编码区cDNA序列长度为849 bp,预测其编码282个氨基酸,包括2个跨膜结构域和1个保守的RING型finger结构域。以野生近缘种的二倍体、四倍体和六倍体普通小麦及一套由中国春为背景的缺-四体为材料,将基因定位在染色体4D上;小麦抽穗期TaSDIR1-D在旗叶中的表达量最高;在NaCl、ABA、PEG及4℃非生物胁迫诱导下,小麦TaSDIR1-D均上调表达,可能参与植物抗逆调节通路;通过检测32份多态性较高的小麦材料TaSDIR1-D基因序列多态性,共检测到2个SNP,基因的编码区和上游序列中各存在1个核苷酸变异,其中编码区的核苷酸变异位点(G/A)位于第4外显子上,为非同义突变,使精氨酸(Agr)变为组氨酸(His)。2个SNP组成两种单倍型,根据-583 bp处的SNP(T/C)设计分子标记SNP-583,扫描自然群体262份材料的基因型,将其分为2种单倍型,分别与千粒重、倒二节长和穗长显著相关或极显著相关,单倍型Hap-4D-2为提高千粒重的优异单倍型。研究结果为小麦分子育种提供了理论依据和基因资源。     

COL9A1基因与先天性马蹄内翻足的相关性研究

应用限制性片段长度多态性技术结合测序方法,分析了84个先天性马蹄内翻足核心家系COL9A1基因内2个SNP位点rs592121与rs1135056的基因型;应用ETDT软件统计分析各SNP位点基因型与先天性马蹄内翻足的相关性;应用TRANSMIT软件构建单倍型并统计分析单倍型频率是否存在差异; 采用半定量RT-PCR方法检测25例马蹄内翻足患儿肌肉及肌腱组织COL9A1基因mRNA的表达。结果发现rs592121及rs1135056位点在先天性马蹄内翻足中均存在传递不平衡( P < 0. 05)。马蹄内翻足患儿组织中COL9A1基因表达水平高于正常组织(t = 4.7500, P < 0. 05)。提示COL9A1基因可能是先天性马蹄内翻足重要的易感基因。