β淀粉样肽单克隆抗体可变区基因的5′RACE扩增及序列分析

目的:克隆并分析抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因。方法:从分泌抗β淀粉样肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株A8中提取总RNA,根据恒定区序列设计基因特异性引物,通过5′RACE法扩增抗体的轻链和重链可变区基因,测定并分析可变区基因序列,并克隆入pMD18-T载体。结果:重链可变区基因序列全长450bp,编码150个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长429bp,编码143个氨基酸残基。在GeneBank中对氨基酸序列进行比对分析,二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。根据Kabat法则对A8抗体轻链和重链可变区氨基酸序列基因进行分析并确定了3个抗原互补决定区(CDR)、4个框架区(FR)和信号肽。结论:通过5′RACE法得到了抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构,以及对该抗体进行人源化改造奠定了基础。     

甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体轻链和重链可变区基因的巢式PCR扩增及序列分析

目的：采用巢式PCR对甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链基因进行扩增,对获得的基因进行序列分析,并找出克隆鼠Igκ轻链和重链可变区基因的通用方法。方法：设计22对扩增鼠Igκ轻链可变区和重链可变区基因的引物,对6株鼠抗人甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链可变区基因进行克隆并测序,与NCBI公布的鼠免疫球蛋白序列比对分析。结果：巢式PCR方法可以有效避免单克隆抗体克隆过程的假基因,并且得到的单克隆抗体的氨基酸序列均符合鼠免疫球蛋白可变区特征。结论：建立了克隆鼠免疫球蛋白轻链和重链可变区基因的通用方法,为后期克隆鼠源性单克隆抗体的可变区基因提供了基础,并为研究甲型H1N1流感病毒血凝素与抗体的结合位点提供了实验数据。     

抗HEV嵌合抗体的构建及在CHO细胞中的表达

通过RT-PCR方法从分泌戊型肝炎(戊肝)病毒中和性鼠源单克隆抗体(单抗)8C11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(VK)序列,并分别克隆到含有人gamma 1重链和kappa轻链恒定区序列的pcDNA3.1/Hygro和pcDNA3.1( )质粒中,共转染中华仓鼠卵巢癌细胞(CHO)细胞.RT-PCR结果表明,转染的CHO细胞转录了嵌合重链及轻链基因,间接ELISA及Western blot结果表明:翻译出的两种多肽在细胞内正确组装成嵌合抗体分子,并可分泌至细胞外,表达的嵌合抗体保留了原鼠单抗的抗原结合特异性及对8H3结合抗原的增强作用.8C11嵌合抗体的成功表达可降低鼠源性,为探讨戊肝抗体治疗的可能性奠定了基础.     

抗胃癌鼠单抗3G_9轻链可变区基因的克隆和序列分析

本文报导了用ＰＣＲ方法（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）从抗胃癌单抗３Ｇ９杂交瘤细胞的基因组ＤＮＡ中,扩增出３３３ｂｐ的轻链可变区基因,克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡｋｓ十／一载体上,筛选到阳性克隆。核苷酸序列分析．表明：有５３％的核苷酸序列与抗体基因库中的一般序列相符。证明已获得抗胃癌单抗轻链可变区基因．     

抗胃癌鼠单抗3Gg轻链可变区基因的克隆和序列分析

本文报导了用ＰＣＲ方法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）从抗胃癌单抗３Ｇｇ杂交瘤细胞的基因组ＤＮＡ中,扩增出３３３ｂｐ的轻链可变区基因,克隆至ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ⅱｋｓ ＋／－载体上,筛选到阳性克隆。核苷酸序列分析表明：有５３％的核苷酸序列与抗体基因库中的一般序列相符。证明已获得抗胃癌单抗轻链可变区基因。     

利用Tol2转座子介导的增强子诱捕技术获得血管相关转基因斑马鱼系

心血管系统形成于胚胎发育极早期并为其他器官的发育、维持、修复所必需,血管生长异常可造成多种疾病.然而,由于研究对象所限,胚胎血管的发育机制尚未完全阐明,调控血管发育的基因也所知有限.通过Tol2转座子介导的大规模增强子诱捕筛选到26个血管特异表达绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的转基因斑马鱼系,其中有一些品系在胚胎的某些特异血管结构中表达绿色荧光.通过linker-mediated PCR克隆到22个鱼系中Tol2插入位点附近的斑马鱼基因组序列,其中有17个鱼系的Tol2插入可定位到现有的斑马鱼基因组中的单一位点.通过整体胚胎原位杂交对插入位点附近的基因进行表达谱分析,得到8个表达谱与转基因鱼系一致的基因,涵盖了9个鱼系,其中dusp5基因对应于2个不同的鱼系.这8个基因中包括hhex、ets1a和dusp5等3个功能已知的基因,但是大部分(5个)基因在斑马鱼中尚无功能研究,分别为zvsg1、micall2a、arl8b(1of2)、zgc:73355以及hecw2(1of2).hhex和ets1a基因对血管与血细胞前体的发育具有重要作用,所获得的EGFP报告基因受hhex或ets1a基因增强子控制的转基因斑马鱼(mp378b和mp430c-2)为国际首例,为深入研究这两个基因在血管与血液发育中的作用机制提供了新的机遇.筛选到的功能未知基因可以用来进一步研究其在血管发育中的功能;同时,利用所获得的转基因鱼系,可以实现实时、动态观察成血管细胞的起源、分化与基因表达调控,并可用于高通量小分子药物筛选等重要研究.     

抗D－双聚体单抗轻链可变区基因的克隆

以分泌小鼠抗人纤维蛋白降解产物D－双聚体单克隆抗体杂交瘤细胞株的mRNA为模板,用小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因的通用引物,通过RT－PCR扩增基因,与载体重组后,经酶切鉴定和核苷酸序列分析,证明克隆含抗D－双聚体单抗的轻链可变区基因,长度为330 bp．     

利用线性表达框高通量表达人源单克隆抗体

目的:建立不通过克隆步骤高通量表达来源于人单个B细胞的抗体轻、重链基因的方法。方法和结果:PCR扩增3个末端重叠的DNA片段,即1CMV启动子和编码抗体引导区序列的片段;2抗体Ig G1重链恒定区序列和牛生长激素(BGH)poly(A)信号序列,轻链Igκ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列,轻链Igλ恒定区序列和BGH poly(A)信号序列;以及3抗体基因可变区序列V_H、V_κ或V_λ。3个片段通过重叠延伸PCR构建全长线性片段即线性表达框,将此来源于人单个B细胞的配对的抗体轻、重链线性表达框共转染293E细胞,72 h收集上清检测到表达的抗体。结论:构建的抗体基因线性表达框是无须克隆,快速高通量表达抗体基因进行筛选分析的策略。     

锌螯合物抗体可变区的克隆鉴定、真核表达及重组抗体的三维模建

筛选得到能分泌抗锌(Ⅱ)-二乙烯三胺五乙酸( Zn(H)-DTPA)的单克隆抗体杂交瘤细胞株2E8E3.经测定,此株细胞分泌IgM,轻链K型抗体.为了得到该抗体可变区序列,分别在小鼠抗体的信号肽区域和抗体的第一恒定区半胱氨酸残基(Cys)附近选择合适引物,通过RT-PCR方法,得到重(VH)、轻(V1)链可变区序列.将序列进行BLAST分析、SignalP分析、IMGT-V/QUEST分析,结果显示,克隆到的VH-2E8E3( 465 bp)和VL-2E8E3( 417 bp),序列与小鼠μ重链,κ轻链抗体可变区序列具有同源性(相似度＞97％),前端序列符合信号肽特征,抗体骨架区( Framework region,FR)及第一恒定区均含有保守半胱氨酸(Cys)残基.在此基础上,构建了重组抗体的真核表达载体,转染293T细胞并用间接ELISA法初步验证其具有表达活性.对重组抗体进行了三维模拟,并推测了主要氨基酸残基.试验结果表明,克隆到了正确的2E8E3抗体可变区序列并初步鉴定为有活性.     

抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体可变区基因的5＇RACE扩增及序列分析

目的：克隆并分析抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体轻链和重链的可变区基因。方法：从分泌抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取总RNA,根据小鼠IgG恒定区序列设计特异性引物,通过5’RACE法扩增其轻链和重链的可变区基因,克隆入pMD18-T载体,测序并分析其可变区序列。结果：3株抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的重链可变区基因序列全长均为423bp,编码141个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长均为393bp,编码131个氨基酸残基;在GenBank中对氨基酸序列进行比对分析,均符合小鼠IgG可变区基因的特征;根据Kabat法则对3株抗体轻链和重链可变区氨基酸序列进行分析,确定了3个抗原互补决定区、4个框架区和前导肽。结论：通过5＇RACE法得到了3株抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构、人源化改造奠定了基础。     

抗人肺腺癌单克隆抗体重,轻链可变区基因的分离克隆和序列测定

根据鼠免疫球蛋白重。轻链可变区基因ＦＲ１和ＦＲ４的序列保守性,化学合成了适于体外扩增Ｉｇ重、轻链可变区基因（Ｖ_Ｈ和Ｖ_Ｌ）的数对引物。以分泌抗人肺腺癌单抗的杂交瘤细胞株ＷＬＡ－２Ｃ４的基因组ＤＮＡ为模板,ＰＣＲ扩增Ｖ_Ｈ和Ｖ_Ｌ基因,分别克隆人ｐＵＣ１９载体。转化子经蓝、白斑筛选,酶切鉴定,双脱氧测序证实确为鼠单抗可变区基因,其中Ｖ_Ｈ基因全长为３４８ｂｐ,编码１１６ａａ,属重链ⅡＢ亚类;Ｖ_Ｌ基因全长３１８ｂｐ,编码１０６ａａ,属Ｋ轻链Ⅵ亚类。     

抗人CD3单抗重、轻链可变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

根据免疫球蛋白重链和轻链可变区基因５’端序列和Ｊ区序列,化学合成适合于体外扩增抗体重、轻链可变区基因的二对引物。从体外培养的ＯＫＴ３杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ,反转录生成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ为模板,分别加入合成的重、轻链可变区引物进行ＰＣＲ,扩增出抗体重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ｐＵＣ１９质粒,筛选出阳性克隆,用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。所测重链可变区基因全长３５７ｂｐ,编码１１９个氨基酸,轻链可变区基因全长３２１ｂｐ,编码１０７个氨基酸。     

鼠抗HFRSV衣壳蛋白McAb F3株可变区基因的获取及特性分析

培养鼠抗肾综合征出血热病毒衣壳蛋白Ｆ３杂交瘤细胞株,提取总ＲＮＡ,根据鼠源ＩｇＧ抗体基因家族可变区基因碱基序列的特点,设计简并引物,通过逆转录聚合酶链反应,获得抗体轻链可变区和重链可变区基因。分别将其克隆入载体ＰＴ７ＢｌｕｅＴ Ｖｅｃｔｏｒ,选取阳性重组克隆各两个,分别测定了所载重链可变区和轻链可变区基因的碱基序列,比较了不同克隆轻链可变区基因之间和重链可变区基因之间碱基序列的差异;分析了各自的氨基酸框架及其对应蛋白的亲水性。结果显示,两个重链可变区基因碱基序列有４处不同,同源性为９７９％;其中重组克隆ＺＧ３６４ ５Ｆ所载重链可变区基因有完整的开放阅读框架,对应的蛋白含有丰富的亲水基因,第１１２氨基酸处亲水性最高;另一重组克隆ＺＧ３６４ ４Ｆ所载重链可变区基因不能通读。两个轻链基因碱基序列有４处不同,同源性为９９１％,重组克隆ＺＧ３６５ ５Ｆ和ＺＧ３６５ ７Ｆ所载轻链可变区基因均有完整的开放阅读框架,对应的蛋白均含有丰富的亲水基因,ＺＧ３６５ ５Ｆ所载基因对应蛋白第６７氨基酸亲水性最高,ＺＧ３６５ ７Ｆ所载基因对应蛋白第３４氨基酸亲水性最高。     

抗HFRSV人单抗可变区基因克隆及其序列测定

从杂交瘤细胞株87—2提取细胞总RNA．反转录合成cDNA链,进行PCR反应。其中扩增重链可变区一对引物分别与人免疫球蛋白重链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补;扩增人λ轻链可变区引物与人免疫球蛋白λ轻链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补。将重、轻链可变区基因的PCR扩增产物分别插入M13噬菌体．经转化筛选分别获得重组克隆。双脱氧法测定其序列,所得核苷酸序列经计算机分析,轻、重链可变区基因长度分别为309bp和405pb,编码103个氨基酸和135个氨基酸,有明显抗体可变区特征,具有骨架区和抗原互补区。     

抗人CD3单抗重,轻链可变区基因的体外扩增,克隆和序列分析

根据免疫球蛋白重链和轻链可变区基因５＇端序列和Ｊ区序列,化学合成适合于体外扩增抗体重、轻链可变区基因的二对引物。从体外培养的ＯＫＴ３杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ,反转录生成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ为模板,分别加入合成的重、轻链可变区引物进行ＰＣＲ,扩增出抗体重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ｐＵＣ１９质粒,筛选出阳性克隆,用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。所测重链可变区基因全长３５７ｂｐ,编码１１９个     

血清学检测H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆的分析

目的 为分析H-Y噬菌体Fab抗体特异性,筛选用于抗体亲和力提高的H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆.方法 以从噬菌体Fab抗体库中筛选到具有雄性特异性结合活性的阳性克隆A6、A8、E6为基础,通过C57BL/6鼠脾细胞为抗原的ELISA分析3株阳性克隆的特异性,镜下观察亲和力较好的A8阳性克隆ELISA结果,利用生物信息学方法预测分析该克隆的抗体基因可变区序列和结构.结果 ELISA分析显示3株阳性克隆具有雄性特异性,其中A8阳性克隆具备较好的雄性特异性.A8克隆具有免疫球蛋白轻链和重链可变区结构,其重链、轻链可变区分别属于VHI和VκIV基因家族.结论 A8阳性克隆可用于后续的导向筛选和抗体基因改造等研究工作.     

HFRSV内影像型抗独特型人单抗重链可变区基因克隆

利用反转录－ＰＣＲ方法,从分泌肾综合症出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）内影像型抗独特型人单抗杂交瘤细胞系（Ｃ８）中,成功地克隆了抗ＨＦＲＳＶ１ｄ人单抗重链可变区基因,并将此基因重组入Ｍ１３噬菌体ＤＮＡ中,测定了此重链可变区基因全序列。经计算机分析,基因全长共３５１ｂｐ、编码１１７个氨基酸,氨基酸序列同源性分析发现所推得的该单抗ＣＤＲ２区与ＨＦＲＳＶＧ２蛋白Ｃ端有同源区,此区可能具有较强的抗原性。     

一株乙酰胆碱受体单克隆抗体的序列分析

探讨重症肌无力自身抗体分子结构及其在发病机制中的作用。利用PCR从分泌乙酰胆碱受体（AChR）单抗A49的杂交瘤细胞株扩增抗体可变区（V）基因,经转化大肠杆菌DH5α克隆后,进行核苷酸序列分析。A49的重性V区基因由小鼠VHNP族基因编码,轻链V区基因由小鼠VK2组基因编码。与致病性AChR抗体V区比较,其同源性均在70％以下。A49的分子结构与致病性AChR抗体不同。     

抗A型肉毒毒素人源三结构域抗体的重组设计与表达

以获得的抗A型肉毒毒素人源单链抗体ScFvB17为模板 ,PCR扩增抗体ScFv基因的重链可变区 (VH)和轻链可变区 (Vκ) ,以重链恒定区 1(CH1) 5′端 12个氨基酸的序列作为连接肽 ,构建成三结构域抗体分子 :VH_连接肽_Vκ(VH Vκ)。重组VH Vκ抗体分子在大肠杆菌中得到高效表达 ,其表达量占菌体总蛋白质的 34%以上。表达的蛋白质在菌内形成包含体 ,采用镍柱金属鏊合层析法对该包含体进行纯化 ,得到了纯度高达 95 %的VH Vκ。ELISA等实验结果显示 ,重组设计并制备的三结构域抗体蛋白VH Vκ不但可以特异识别毒素抗原 ,具有与原母本单链抗体ScFv相同的抗原特异性 ,而且具有了更高的相对亲和力和稳定性。     

抗FKBP52人源单链抗体的筛选及其完整抗体真核表达载体的构建

目的:从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗FKBP52人源单链抗体,并进一步构建其真核表达载体。方法:以FKBP52为抗原,通过吸附、扩增、洗脱等过程,从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性单链抗体,采用ELISA方法进行特异性测定,采用生物膜干涉方法测定亲和力,再经同源重组方法构建完整抗体的真核表达载体,通过PCR及序列测定对构建的载体进行验证。结果:经过4轮筛选,获得15种与FKBP52特异结合的噬菌体抗体,其中7种得到可溶性表达;序列分析表明,7种单链抗体重链可变区分属VHⅠ、VHⅢ和VHⅣ亚群,轻链可变区分属VκⅠ、VκⅢ和VλⅠ亚群;特异性结合活性较好的4株抗体的亲和常数分别为9.723×10-8、3.500×10-8、1.203×10-8和5.323×10-8;将亲和力较好的一株单链抗体轻、重链可变区基因分别拼接到含有人κ及Ig G1恒定区基因的p CMV-L和p CMV-H真核表达载体中。结论:筛选获得多株人源抗FKBP52单链抗体,并构建了完整抗体的真核表达载体。