Ad5-knob蛋白在大肠杆菌中可溶性表达及其活性检测

采用PCR技术, 从AdEasy-1质粒DNA中获得knob全长序列, 克隆入pGEM-T vector中.DNA测序鉴定后, 构建pQE-30/knob重组表达载体, 转化大肠杆菌M15 pREP4),IPTG诱导表达腺病毒5型纤维蛋白的knob功能域(Ad5-knob), SDS-PAGE分析,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中.经Ni2+-NTA亲和层析一步分离纯化后,洗脱产物中Ad5-knob蛋白纯度超过95%.N-端氨基酸测序证实了纯化产物为Ad5-knob蛋白,细胞受体结合实验检测到所得蛋白能够与Hela细胞上的相应受体特异性结合.上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性Ad5-knob蛋白,一步即纯化该蛋白,并具有良好的生物活性,为其下阶段的深入研究提供了重要的实验材料.     

斑马鱼胚胎第一次卵裂过程中胞内钙信号的研究

钙离子作为广泛存在的细胞内信使物质,在动物胚胎早期发育过程中扮演重要角色.为了研究钙离子在斑马鱼胚胎发育过程中的空间分布和浓度变化,采用Fluo-4和Indo-1作为钙离子指示剂,利用激光共聚焦和双波长荧光比例成像技术,对斑马鱼胚胎第一次卵裂过程中的钙信号进行了详细的跟踪观察.在第一次卵裂过程中,斑马鱼胚胎的动物极顶端首先出现高钙斑,然后在分裂沟部位出现高浓度的钙信号,这一信号在卵裂过程中持续存在.利用Indo-1双波长荧光比例成像对上述过程中钙离子的时空分布进行了定量测定,表明,胞内钙离子在卵裂开始之前是均匀分布的,随着分裂沟的出现,其附近区域的钙浓度显著升高,而胞内其他区域的钙浓度则保持不变.双波长荧光比例成像排除了荧光染料分布不均匀造成的干扰,为钙信号与胚胎分裂的密切关系提供了确凿的定量依据.     

单细胞转录组分析研究进展

目前常规的转录组分析方法无法揭示单个细胞之间基因表达的异质性,也难以对极少量细胞进行分析,单细胞转录组分析技术为此提供了有效的研究工具。对单细胞转录组分析技术的历史、发展、策略、方法和应用进行综述。     

利用Tol2转座子介导的增强子诱捕技术获得血管相关转基因斑马鱼系

心血管系统形成于胚胎发育极早期并为其他器官的发育、维持、修复所必需,血管生长异常可造成多种疾病.然而,由于研究对象所限,胚胎血管的发育机制尚未完全阐明,调控血管发育的基因也所知有限.通过Tol2转座子介导的大规模增强子诱捕筛选到26个血管特异表达绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的转基因斑马鱼系,其中有一些品系在胚胎的某些特异血管结构中表达绿色荧光.通过linker-mediated PCR克隆到22个鱼系中Tol2插入位点附近的斑马鱼基因组序列,其中有17个鱼系的Tol2插入可定位到现有的斑马鱼基因组中的单一位点.通过整体胚胎原位杂交对插入位点附近的基因进行表达谱分析,得到8个表达谱与转基因鱼系一致的基因,涵盖了9个鱼系,其中dusp5基因对应于2个不同的鱼系.这8个基因中包括hhex、ets1a和dusp5等3个功能已知的基因,但是大部分(5个)基因在斑马鱼中尚无功能研究,分别为zvsg1、micall2a、arl8b(1of2)、zgc:73355以及hecw2(1of2).hhex和ets1a基因对血管与血细胞前体的发育具有重要作用,所获得的EGFP报告基因受hhex或ets1a基因增强子控制的转基因斑马鱼(mp378b和mp430c-2)为国际首例,为深入研究这两个基因在血管与血液发育中的作用机制提供了新的机遇.筛选到的功能未知基因可以用来进一步研究其在血管发育中的功能;同时,利用所获得的转基因鱼系,可以实现实时、动态观察成血管细胞的起源、分化与基因表达调控,并可用于高通量小分子药物筛选等重要研究.     

单细胞转录组高通量测序分析新进展

细胞异质性是生物组织的普遍特征。常规转录组测序(RNA-Seq)技术需要上万个细胞,所测结果实际上是一群细胞基因表达的平均值,所以难以鉴别细胞之间基因表达的异质性。单细胞RNA-Seq技术的分辨率精确至单个细胞,为辨别异质性群体中各种细胞类型的转录组特征提供了有力的工具。近年来单细胞RNA-Seq技术发展迅速,在方法学上包括cDNA扩增方法的多样化、对灵敏度和技术噪声的定量分析、浅覆盖高通量单细胞RNA-Seq方法和原位RNA-Seq技术等;在技术应用方面应用范围从早期胚胎发育扩大到组织器官发育、免疫和肿瘤等多个领域。文章对单细胞RNA-Seq在方法学和技术应用两方面的研究进展进行了详细阐述。