含原核翻译增强子T7g10L的表达载体pSC34的构建及其初步应用

利用大肠杆菌表达系统进行基因表达,获取自然界含量极微的蛋白质,是目前基因工程中较常用的一种方法。1988年Olins在研究T7噬菌体时,发现该噬菌体基因10的先导序列(T7g10L)具有明显的促进基因翻译的作用,并称之为“原核翻译增强子”。本室在构建新型表达载体时,亦将其引入,所构建的含T7g10L的     

重组人蛋白质二硫键异构酶活性片段的克隆与表达纯化策略

蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide somerase,PDI)在体内或体外均可以非特异地催化其它蛋白质的二硫键的形成、还原和异构化,进而辅助蛋白的折叠和复性。近来发现PDI还具有非ATP依赖的分子伴侣的功能。鉴于PDI具有的重要功能,拟利用PDI来辅助基因工程产品的复性,如包含体蛋白(尤其是含有二硫键的蛋白),这将为基因工程产品的下游纯化复性,开拓新的思路。PDI含有两个硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)同源区a区和a′区,各含有一个CGHC活性位点,与TRX的CGPC位点同源。a区和a′区各具有50％的二硫键异构     

含翻译增强子的表达载体pSC34的构建及初步应用

１９８８年Ｏｌｉｎｓ［１］发现Ｔ７噬菌体基因１０的先导序列（Ｔ７ｇ１０Ｌ）具有明显的促进基因翻译的作用．本文构建了含Ｔ７ｇ１０Ｌ的表达载体ｐＳＣ３４,并尝试表达了几个不同类型的基因．１材料与方法１．１菌株大肠杆菌菌株ＴＡＰ１０６为本室储存．ＴＡＰ１０...     

新型表达载体 pEC34 试用于人 γ 干扰素基因的高表达

构建了一个新的双顺反子表达载体ｐＥＣ３４,它的第一个顺反子是已高表达的ｅｒａ基因的部分序列,并带有原核翻译增强子。当检测ｐＥＣ３４的可用性时,获得了人γ－干扰素的极高表达。目的蛋白占菌体总蛋白的８５．５％,诱导后经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,出现分子量为１５．５ｋＤａ左右的蛋白表达带。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果证实为人γ－干扰素。无压力传代３０次表达质粒仍然稳定,表明ｐＥＣ３４可能用作真核蛋白质高表达     

黑色素瘤相关抗原家族新基因restin的组织表达谱

Restin是从维甲酸诱导肿瘤分化细胞中克隆的一种黑色素瘤相关抗原家族(MAGE)的新成员.对该基因在不同组织、不同细胞系的表达水平进行研究,将有利于揭示其生物学功能.使用α3-2P-dCTP标记人restin编码区基因作为探针,针对12种不同成人组织mRNA的Multiple TissueNorthern(MTN)膜和含76种成人、胎儿及常用细胞系mRNA的Multiple Tissue Expression(MTE)Array膜进行杂交分析,同时利用地高辛标记探针对11种常见肿瘤组织进行原位杂交检测.结果显示,MTN膜杂交中,12种组织显示均一杂交条带,约1.8 kb,提示该基因可能不存在剪接变异体;MTE膜杂交中,正常组织中均有不同程度的表达,但在肿瘤细胞系中均低表达或者不表达;原位杂交的结果显示,在8种恶性肿瘤组织中均不表达,而在3种良性肿瘤组织中呈现较低的表达.结果提示,该基因在正常组织中的表达明显高于肿瘤组织和肿瘤细胞系,完全不同于其它MAGE-A、B、C的组织表达方式.结合该基因在维甲酸诱导分化的肿瘤细胞中高表达,推测restin可能与正常细胞的分化、增殖有关.     

新基因Restin的克隆及比较生物学分析

采用PCR介导的减法杂交技术,从全反式维甲酸诱导的HL-60细胞中克隆得到一新基因,该基因编码219个氨基酸.借助生物信息学分析技术,发现该基因表达蛋白与神经细胞生长抑制因子(Necdin)的功能结构域高度同源(49%),均为碱性蛋白,命名为Restin(细胞静息相关蛋白).更有意义的是,同源搜索发现Restin,Necdin和Mages(黑色素瘤相关抗原家族)为同一蛋白家族,提示Restin和Mages是两类具有某种联系而功能又不同的蛋白质. 对所有这些蛋白进行综合分析发现,它们分别属于两个不同的亚家族,碱性蛋白家族和酸性蛋白家族,其中Restin,Necdin和Mage D1含有碱性同源结构域(理论pI为8.6～10.1), 主要在终末分化细胞中表达,在肿瘤组织极少表达或不表达,实验结果表明,Necdin可以与转录因子(E2F1)及p53相互作用,从而抑制细胞增殖,推测此类蛋白可能与细胞静息状态相关;而Mage A,C等表现为酸性同源结构域(理论pI为4.2～4.9),主要在肿瘤组织和胎儿组织中表达,推测此类蛋白可能与细胞增值有关.这两类蛋白是否构成一对与细胞周期调控相关的正负系统值得进一步深入研究.     

树突状细胞特异表达新基因的大规模筛选

 树突状细胞在抗原提呈过程中起极其重要的作用．为大规模筛选抗原刺激后人树突状细胞特异表达基因,建立了一种基于“长距离” Ｐ Ｃ Ｒ 技术的减法杂交技术,在实验中取得了较好的效果．初步测序分析了 ２００ 个插入片段为 ０７～２ ｋｂ 的克隆,结果发现新基因片段占 ５０％ ,其中 ３０％ 的片段包含基因编码区,１５％ 的片段包含完整编码区,打点杂交分析新基因中 ８０％ 为抗原刺激后树突状细胞所表达．从已知和未知基因中发现了一些与树突状细胞生物学功能可能相关的基因,这将有助于进一步揭示与阐明树突状细胞的生物学功能．更多及更长片段的测序工作正在进行中．     

HFRSV内影像型抗独特型人单抗重链可变区基因克隆

利用反转录－ＰＣＲ方法,从分泌肾综合症出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）内影像型抗独特型人单抗杂交瘤细胞系（Ｃ８）中,成功地克隆了抗ＨＦＲＳＶ１ｄ人单抗重链可变区基因,并将此基因重组入Ｍ１３噬菌体ＤＮＡ中,测定了此重链可变区基因全序列。经计算机分析,基因全长共３５１ｂｐ、编码１１７个氨基酸,氨基酸序列同源性分析发现所推得的该单抗ＣＤＲ２区与ＨＦＲＳＶＧ２蛋白Ｃ端有同源区,此区可能具有较强的抗原性。     

人骨形成蛋白-2A与小鼠成骨细胞表面特异性结合的研究

作者证实在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白-２Ａ（ｈＢＭＰ２Ａ）Ｃ端肽段具有骨诱导活性,再利用噬菌体呈现载体克隆并表达了ｈＢＭＰ２ＡｃＤＮＡ３’端５６７个核苷酸,表面呈现有人ＢＭＰ２ＡＣ端肽段的噬菌体与小鼠成骨细胞系（ＭＣ３Ｔ３）能够特异地结合,用抗Ｍ１３噬菌体抗体进行ＥＬＩＳＡ实验呈阳性反应,同时用^３ＨＴｄＲ参入重组ＢＭＰ２Ａ噬菌体时放射性计数比对照组高近１０倍,推测小鼠成骨细胞表面存在有人ＢＭＰ２Ａ受体。     

血小板生成素功能区段基因的克隆与表达

血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是由巨核细胞产生的一种细胞因子,早期认为它在血小板生成晚期发挥作用。1994年TPOcDNA克隆成功,从而使得对血小板生成素的研究更加深入。TPO cDNA全长1774 bp,其中编码区为1059 bp,编码353个氨基酸,从其结构上看,它可以分为N端区和C端区两部分,其N端区与EPO同源性较高,称为EPO样结构区(EPO-like domain),而且仅此结构区即具有完整TPO分子的功能。TPO与EPO不但在