人胰腺α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用

【目的】针对人胰腺α-淀粉酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人胰腺α-淀粉酶;利用酶的催化特性建立α-淀粉酶抑制剂筛选模型;应用该模型对放线菌发酵液冻干物进行高通量筛选;通过构建16S rRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】成功克隆、表达了具催化活性的人胰腺α-淀粉酶;建立了α-淀粉酶抑制剂的筛选模型;对近2000株放线菌的发酵液冻干物进行高通量筛选,最终得到14株α-淀粉酶抑制剂产生菌株,且在分类学上具有丰富的菌种多样性。【结论】本研究建立的α-淀粉酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型淀粉酶抑制剂类降糖药物的开发。     

α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用

【目的】针对人α-麦芽糖苷酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人α-麦芽糖苷酶。利用酶的催化特性建立α-糖苷酶抑制剂筛选模型。应用该模型对放线菌代谢产物库进行高通量筛选。通过构建16SrRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】首次成功克隆、表达了具催化活性的人α-麦芽糖苷酶N端结构域。针对人α-麦芽糖苷酶N端催化结构域,建立α-糖苷酶抑制剂的筛选模型。对包含近2000株放线菌代谢产物的天然产物库进行高通量筛选,最终得到20株α-麦芽糖苷酶抑制剂生产菌株。其中19株放线菌为链霉菌属,且在分类学上具有丰富的多样性。【结论】本研究建立的α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型糖苷酶抑制剂类降糖药物的开发。     

α-葡萄糖苷酶抑制剂HW110产生菌的研究

目的:筛选新的α-葡萄糖苷酶抑制剂。方法:采用α-淀粉酶及蔗糖酶抑制试验,从2000株放线菌发酵液中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。结果:从淡紫灰链霉菌HW110(Streptomyces lavedulae HW110)发酵液中分离到HW110,其抑酶活性与acarbose相当。结论:利用α-淀粉酶及蔗糖酶抑制试验筛选到deoxynorjirimycin。     

1株产α-糖苷酶抑制剂放线菌的筛选与鉴定

利用酶的催化特性从520株土壤分离放线菌中筛选对α-淀粉酶和α-蔗糖酶均具有抑制作用的产α-糖苷酶抑制剂菌株,并对其进行菌株归属鉴定。试验结果表明:从土壤分离放线菌中筛选到对α-淀粉酶酶活力抑制率在75%以上的菌株45株,从这45株放线菌中筛选到1株对α-蔗糖酶抑制率在40%以上的菌株。通过对其进行形态学观察、生理生化特性鉴别,并结合16S rRNA基因序列分析,初步判定该菌株为天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolo。     

以蛋白激酶G为靶点的抗结核药物筛选模型的建立和初步应用

结核分枝杆菌可以产生11种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其中蛋白激酶G(PknG)对于结核分枝杆菌在巨噬细胞内以"持留"状态长期存活有着重要作用。本研究以结核分枝杆菌基因组DNA为模板,在大肠杆菌中克隆表达了MTBPknG蛋白,并分离纯化得到PknG纯酶。本研究还采用三步级联反应方法测定了PknG酶活性,建立和优化了PknG抑制剂高通量筛选模型。利用此模型共筛选发酵液样品2120个,化合物样品2300个,筛选得到阳性化合物1个,阳性发酵液13个,阳性率0.32%。     

以苯丙氨酰-tRNA合成酶为靶点的新型抗结核药物高通量筛选模型的建立和应用

【目的】建立结核分枝杆菌PheRS抑制剂高通量模型,并运用此模型筛选化合物和发酵液样品。【方法】克隆和表达结核分枝杆菌PheRS蛋白并优化其酶活测定方法,在此基础上建立结核分枝杆菌PheRS抑制剂高通量筛选模型,并通过耻垢分枝杆菌作为检定菌对筛选到的样品进行抗菌活性测定及细胞毒性评价。【结果】运用此模型筛选了化合物样品11 600个,发酵液样品5 200个,筛选得到阳性化合物9个,阳性发酵液37个。而后通过耻垢分枝杆菌作为检定菌的抗菌活性测定及细胞毒性评价后,得到了6个发酵液阳性样品。【结论】建立的PheRS抑制剂模型可成功用于化合物和微生物发酵液的高效筛选,得到的6个发酵液阳性样品在酶水平和抗分枝杆菌方面均具有良好活性且毒性较低,值得进一步研究。     

绿脓杆菌SecA ATPase抑制剂筛选模型的建立和应用

Sec途径(分泌途径,Secretion pathway)是蛋白质转运的主要途径。其中,SecA ATPase是蛋白质转运途径中的"动力泵",它通过ATP的水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜。SecA蛋白在细菌中是独有且不可缺少的。克隆和高效表达绿脓杆菌PasecAN75蛋白(绿脓杆菌SecA蛋白N端645个氨基酸残基组成的片段,大小约75 kD)并优化其ATPase酶活测定体系,在此基础上建立了更为灵敏的SecA蛋白ATPase活性抑制剂的筛选模型。运用该模型从化合物库的3220个样品中筛选得到可抑制绿脓杆菌SecA ATP酶的活性阳性化合物4个,从7196个微生物发酵液中得到66个阳性样品,筛选阳性率为0.67%(以抑制率大于30%为筛选阳性标准)。而后通过已建立的细胞水平筛选模型对其抗菌活性进行验证。研究结果表明3个化合物样品和6个发酵液样品在酶水平和细胞水平对绿脓杆菌SecA ATPase均有较好的抑制作用,值得进一步研究。     

两种α-糖苷酶抑制剂体外筛选模型的改良与比较

α-糖苷酶抑制剂可以控制餐后血糖浓度波动,从而达到预防和治疗糖尿病的作用。本文对两种α-糖苷酶抑制剂体外筛选模型进行了改进。结果表明,以阿卡波糖作阳性对照,两种模型均适用于以脱脂乳为生长介质的产α-糖苷酶抑制剂的乳酸菌的筛选。选取12株特定乳酸菌分别用两种模型测其发酵脱脂乳上清对α-糖苷酶的抑制活性,两种模型筛选结果一致,但测得的抑制活性呈现一定的差异。当加入到脱脂乳中的阿卡波糖浓度较低时,以麦芽糖为底物的酶-抑制剂模型测得的α-糖苷酶抑制活性高于以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物的酶-抑制剂模型。     

中药提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选

目的：从中药中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。方法：采用α-葡萄糖苷酶、淀粉酶以及蔗糖酶活性测定方法,对126种经水煮醇沉提取的常用中药进行α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选。结果：在0．28mg／ml反应体系下,24种中药提取物显著抑制α-葡萄糖苷酶活性;在0．1mg／ml反应体系下,5种中药提取物抑制α-淀粉酶活性。大黄、山茱萸、赤芍、五倍子对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶以及转化酶活性均有抑制作用,与阳性药物拜唐苹比较,这4种中药抑制α-淀粉酶的活性较低,但抑制α-葡萄糖计酶和转化酶的活性明显强于拜唐苹。结论：某些中药提取物能显著抑制α-葡萄糖苷酶活性,如果对其进一步分离、纯化并提取活性部位,可望获得抑制活性更强的中药α-葡萄糖苷酶抑制剂。     

广西山口红树林内生放线菌的分离、筛选及初步鉴定

从广西山口国家红树林生态自然保护区采集8种真红树植物和5种半红树植物的根、茎、叶及胚轴等组织样品共计41份。经过表面消毒后粉碎,分别以几丁质、腐殖酸、木聚糖等作为主要营养及能量来源设计了8种分离培养基,从植物组织中分离得到118株放线菌。使用6种新药筛选模型对分离菌株进行了生理活性筛选,77株放线菌的发酵液样品在一个或多个药物筛选模型中显示为阳性,初筛阳性率为65.3%。对77株筛选阳性菌株进行的初步分类研究结果显示,其中44株属于链霉菌属,25株为小单孢属的菌株,3株属于糖丝菌属,3株为诺卡氏属菌株,1株是拟诺卡氏属菌株,1株是伦茨氏菌属的菌株。对一株在抗多重耐药检定菌HH22和降血脂模型上都显示出良好活性的菌株I07A-01824进行表型和基因型分析,确定I07A-01824为黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus)菌株。该研究显示,红树植物内生环境不仅仅孕育了丰富多样的内生放线菌,而且红树植物内生放线菌也是新型天然生理活性次级代谢产物的有效来源。     

高效液相色谱法测定灰兜巴对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

研究灰兜巴醇提石油醚萃取、醇提乙酸乙酯萃取、醇提正丁醇萃取、醇提萃取剩余部分和水提部分对于α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,并通过高效液相色谱检测在药物与酶反应过程中振荡对于α-葡萄糖苷酶抑制率的影响。结果显示,灰兜巴各提取部分均表现出良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,为一种良好的α-葡萄糖苷酶抑制剂,且振荡对其抑制率的影响较大,在反应过程中应使酶与药物充分结合。     

石榴花中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选研究

为确定石榴花中抑制α-葡萄糖苷酶的有效活性部位,针对α-葡萄糖苷酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,实时追踪α-葡萄糖苷酶的抑制率,筛选出pH 8.0的水溶液为最佳提取溶剂。结果表明：正丁醇萃取部位经丙酮沉淀后,半抑制浓度IC50为4.36 mg/mL,该沉淀经70%乙醇洗脱部位对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高。石榴花中皂甙粗提物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于其他活性成分,IC50为3.853 mg/mL。石榴花是一种天然、有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂来源。     

河北九莲城淖尔可培养放线菌多样性及抗菌活性筛选

【目的】勘探干涸的九莲城淖尔土壤放线菌多样性并进行活性筛选,以期发现药用微生物资源,为新抗生素的发现奠定基础。【方法】采用15种分离培养基,以稀释涂布法分离放线菌;根据分离菌株的16S rRNA基因序列同源性分析放线菌多样性;发酵液经乙酸乙酯萃取,菌丝体经丙酮浸提,获得提取浓缩物样品;样品通过纸片扩散法进行抗菌活性初筛;抗菌阳性菌株采用PCR技术进行Ⅰ型聚酮合酶(PKS I)KS域、Ⅱ型聚酮合酶(PKS II)KS域和非核糖体多肽合成酶(NRPS)A结构域抗生素生物合成基因的检测。【结果】从11份盐湖土壤样品中分离纯化到251株放线菌,其分布于放线菌纲的10个目15个科31个属,其中优势菌属为链霉菌属和拟诺卡氏菌属;251株放线菌中包括57株耐(嗜)盐放线菌,其优势菌属为拟诺卡氏菌属(22株)和涅斯捷连科氏菌属(15株)。基于16S r RNA基因序列的系统发育分析显示,菌株J11Y309为糖霉菌科潜在新属,菌株J12GA03为分枝杆菌科潜在新种。96株放线菌活性检测结果显示,56株至少对1株检定菌具有抗菌活性,阳性率为58.3%;56株有活性的放线菌中,47株至少含有1种抗生素生物合成基因,其中17株同时具有3种抗生素生物合成基因。【结论】干涸的九莲城淖尔土壤中含有较为丰富的药用放线菌资源,具有从中发现放线菌新物种和新抗生素的潜力。     

固液态发酵条件对桑叶发酵提取物中降糖活性物质的影响

目的:探讨不同发酵条件对桑叶总黄酮、总多酚含量及体外降糖活性的影响。方法:本研究主要利用比色法考察固态、液态两种发酵条件对桑叶发酵物中总黄酮、总多酚含量的影响,同时建立α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶为体外降糖活性筛选模型,以期筛选最佳发酵条件。结果:液体发酵7 d桑叶70%乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶抑制率最高(92.79%);未发酵水提取物对α-淀粉酶抑制率最高(63.68%),其次为液体发酵7 d桑叶70%乙醇提取物(54.81%)。且在生药浓度为10 mg·m L-1时,都高于阳性对照阿卡波糖。结论:利用冠突散囊菌发酵,可以改变桑叶提取物的体外降糖活性,为开发糖尿病药物提供可行思路。     

藏药材诃子中3种α-葡萄糖苷酶抑制剂的分离与鉴定

通过超滤-高效液相色谱法筛选诃子提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,采用大孔吸附树脂和半制备高效液相色谱对其进行富集和分离制备,~1H NMR和~(13)C NMR鉴定其化学结构,最后采用以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物的酶抑制剂筛选模型检测目标化合物的活性。结果显示:诃子提取物中含有的3个主要成分具有潜在的α-葡萄糖苷酶抑制活性;经筛选,AB-8大孔树脂对目标化合物富集效果最好,富集后目标化合物的峰面积比分别达到29.6%、40.3%和21.9%;由半制备高效液相色谱对目标化合物进一步纯化后,得到纯度分别为96.6%、98.1%和96.4%的化合物1(27 mg)、2(35 mg)和3(22 mg);经~1H NMR和~(13)C NMR鉴定得出3个化合物分别为诃黎勒酸、诃子酸、鞣花酸;活性测试结果表明,3个化合物均具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制作用,其中诃黎勒酸(IC_(50)=39.2±0.7 mg/L)和诃子酸(IC_(50)=35.8±0.4 mg/L)抑制活性大于阳性对照阿卡波糖(IC_(50)=41.2±0.6 mg/L)。本试验为开发诃子中的α-葡萄糖苷酶抑制剂提供了科学依据。     

一株产α-葡萄糖苷酶抑制剂的牛类芽孢杆菌BD3526

为拓宽α-葡萄糖苷酶抑制剂的微生物来源,筛选一株具有降糖效果的菌株。实验利用体外模型对西藏生牦牛乳来源的菌株进行初筛和复筛,获得一株具有α-葡萄糖苷酶高抑制活性的类芽孢杆菌Paenibacillus bovis BD3526,该菌株的降糖活性(>60%)显著高于其他分离菌株和常规乳酸菌。菌株产α-GI的遗传性状稳定有效,中温、好氧发酵更有利于该菌株合成与积累活性物质。当在脱脂乳中发酵12h后,活菌总数达到峰值1.75×10^9CFU/mL,6h后的发酵乳的糖苷酶抑制活性均处于高水平(>80%),不断递减的IC50表明,α-GI伴随着发酵程度的加深在进一步积累。     

热带药用植物根际放线菌的分离、鉴定及生物活性分析

从海南热带植物园采集12种药用植物的根际土样,采用选择性分离方法,分离得到400株根际放线菌。使用5种活性筛选模型对分离菌株进行生物活性评价,154株放线菌在一个或多个活性筛选模型中显示为阳性,菌株初筛阳性率达38.5%;根据菌株形态特征并结合代谢产物的生物活性,从中挑选出28株菌进行16S rRNA基因序列分析,发现其分属于链霉菌属、诺卡氏菌属、小单孢菌属和野野村菌属。     

基于选择性抑制mPGES-1的表达筛选抗炎中药

通过建立的选择性膜型前列腺素E2合酶-1(mPGES-1)表达抑制剂的体外细胞筛选模型,对50味中药共236个样品进行筛选。初筛中,筛选中药不同极性提取物对mPGES-1表达的抑制作用,抑制率50%的样品进入复筛;复筛中,检测初筛活性样品对环氧化酶(COX)-1和COX-2表达的抑制作用,抑制率均20%的样品认为是阳性物。结果表明,吲哚美辛对3种酶的抑制活性与文献报道相近;筛选发现泽泻组分1、蒲黄组分2对mPGES-1的表达有可重复的选择性抑制作用,对泽泻组分1、蒲黄组分2进行进一步研究,有望确定其抗炎的有效部位或化合物。     

天然来源α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法的研究进展

α-葡萄糖苷酶抑制剂(alpha-glucosidase inhibitors,AGI)是一类通过延缓肠道内碳水化合物的水解和吸收从而到达有效控制餐后血糖上升的糖尿病治疗药物,具有控制餐后血糖、保护胰岛细胞功能及改善多种糖尿病并发症等作用。近10年来,α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选方法由传统的筛选模型迅速发展到多种新技术的应用,各种新型筛选模型不断发展应用,从天然资源中寻找新的α-葡萄糖苷酶抑制剂已成为现如今防治糖尿病的研究热点。本文对α-葡萄糖苷酶抑制剂的降糖机制及作用特点、从天然资源中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的模型和方法等内容进行整理和归纳,重点对近10年来国内外从天然资源中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的新型筛选模型和方法进行总结和比较,探讨各类方法的特点、存在的问题以及研究思路,为寻找和发现天然α-葡萄糖苷酶抑制剂提供基础。     

细菌除草剂马唐致病菌的筛选

为研制出针对玉米田杂草马唐的生物除草剂,通过对其感病茎、叶和根际土壤的分离,利用毒素对大肠杆菌的拮抗性,谷氨酰胺合成酶抑制剂模型和皿栽、盆栽筛选模型进行快速、高效的筛选,建立起一种集初筛、复筛、回接于一体的细菌除草剂筛选模型,筛选到一株产红色素的细菌S4,生物测定结果表明:对马唐萌发抑制率达93%,对根长抑制率为85%;除草活性实验发现对小麦有轻微抑制作用,对玉米和黄豆有明显的促生长作用。