α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用

【目的】针对人α-麦芽糖苷酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人α-麦芽糖苷酶。利用酶的催化特性建立α-糖苷酶抑制剂筛选模型。应用该模型对放线菌代谢产物库进行高通量筛选。通过构建16SrRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】首次成功克隆、表达了具催化活性的人α-麦芽糖苷酶N端结构域。针对人α-麦芽糖苷酶N端催化结构域,建立α-糖苷酶抑制剂的筛选模型。对包含近2000株放线菌代谢产物的天然产物库进行高通量筛选,最终得到20株α-麦芽糖苷酶抑制剂生产菌株。其中19株放线菌为链霉菌属,且在分类学上具有丰富的多样性。【结论】本研究建立的α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型糖苷酶抑制剂类降糖药物的开发。     

微生物源α-淀粉酶抑制剂研究进展

微生物源α-淀粉酶抑制剂能特异性抑制哺乳动物和某些微生物的α-淀粉酶,在医药上有重要的应用价值,因而成为近年来新的研究热点.论述了国内外分离纯化的微生物源α-淀粉酶抑制剂,对其蛋白、基因结构、作用机理及应用前景等作了概述.     

淀粉酶抑制剂与抗虫的研究进展

本文综述了α淀粉酶抑制剂对α淀粉酶特异性抑制的分子机制,以及α淀粉酶抑制剂在转基因抗虫方面的研究现状和应用前景。     

小麦α-淀粉酶抑制剂减肥作用的实验研究

研究小麦中α-淀粉酶抑制剂对肥胖症大鼠的影响。将肥胖大鼠随机分为以下5组:模型对照组、阳性药对照组(曲美3 mg/kg),α-淀粉酶抑制剂45,15,5 mg/kg 3个剂量组。其中阳性药对照组和AI组从造模当天起每天ig给药一次,模型空白组则ig同体积的生理盐水,连续灌胃4周,动态检测质量、体长。在实验结束时,各给药组与模型组相比较,Lee指数和脂肪湿重都有不同程度的降低,其中高剂量组变化明显,与曲美组比较效果相当。高、中剂量的α-淀粉酶抑制剂能有效地减少营养性肥胖大鼠的质量和体内脂肪,且AI的减肥效应与其剂量呈正相关性。     

1株产α-糖苷酶抑制剂放线菌的筛选与鉴定

利用酶的催化特性从520株土壤分离放线菌中筛选对α-淀粉酶和α-蔗糖酶均具有抑制作用的产α-糖苷酶抑制剂菌株,并对其进行菌株归属鉴定。试验结果表明:从土壤分离放线菌中筛选到对α-淀粉酶酶活力抑制率在75%以上的菌株45株,从这45株放线菌中筛选到1株对α-蔗糖酶抑制率在40%以上的菌株。通过对其进行形态学观察、生理生化特性鉴别,并结合16S rRNA基因序列分析,初步判定该菌株为天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolo。     

离子交换法纯化α-淀粉酶抑制剂

采用离子交换法,利用弱碱性阴离子交换树脂D315吸附小麦粉初提液中的α-淀粉酶抑制剂,对其静态吸附以及洗杂洗脱条件进行研究。通过对静态吸附条件的摸索,得出静态下的最佳工艺条件:上样料液的蛋白质量浓度ρ0=2.5~3.5 mg/mL、pH=8.5~9.5、温度t=30℃、转速150 r/min。最佳洗脱条件:0.1 mol/L NaCl洗杂,0.5mol/L NaCl洗脱。在该条件下,α-淀粉酶抑制剂纯化倍数为4.25倍,收率为64.58%。     

枯草杆菌α-淀粉酶基因克隆及其在毕赤酵母中表达的初步研究

以B.subtilis XL-15基因组为模板,运用PCR法成功克隆了α-淀粉酶基因,其开放式阅读框(ORF)为1980bp,编码659个氨基酸残基。分别将该基因转入大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中,进行诱导表达。结果表明,大肠杆菌破碎上清液中未检出酶活,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物均以无活性包涵体存在;而毕赤酵母在α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,经高密度培养,表达产物分泌至胞外,发酵液酶活力为4.3U/ml,实现了B.subtilis α-淀粉酶基因的分泌表达。     

以Neprilysin蛋白酶为靶标的药物筛选模型的建立及应用

目的:建立以蛋白酶Neprilysin(NEP)为靶点的高通量药物筛选模型,应用该模型筛选抑制剂。方法:利用毕赤酵母表达系统。构建重组质粒p PICZα-A-NEP,表达载体通过与酵母菌X-33基因组染色体发生同源重组,将外源基因整合于染色体后实现目的蛋白的表达。应用荧光共振能量转移法(FRET)检测蛋白酶活性,优化反应条件,建立药物筛选体系,筛选抑制剂。结果:成功构建表达载体p PICZα-A-NEP;建立了以NEP为靶标的药物筛选模型,获得模型反应动力学参数Vmax=3.6μM/s,Kcat/Km=4.5×105M-1s-1,测定模型Z-因子为0.89,说明体系稳定可用于以NEP为靶标的药物的高通量筛选;并用该模型对天然产物组分库进行筛选,在0.5mg/ml的药物浓度下,得到抑制率较高的药物为4种,并测得半数抑制浓度IC50值,其中MDCNCL01000242的IC50值最低,为(8.31±0.03)μg/ml。结论:建立的药物筛选模型较为理想,适用于NEP抑制剂的筛选,可促进药物的研发。     

毕赤酵母液滴微流控高通量筛选方法的建立与应用

巴斯德毕赤酵母是当前应用最为方便和广泛的外源蛋白表达系统之一,为了进一步提高其表达外源蛋白的能力,文中建立了基于液滴微流控的毕赤酵母高通量筛选方法,并以木聚糖酶融合荧光蛋白为例,筛选获得木聚糖酶表达和分泌能力提高的突变株。通过PCR扩增得到木聚糖酶xyn5基因和绿色荧光蛋白gfp基因融合片段,并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中构建出木聚糖酶融合绿色荧光蛋白的质粒pPIC9K-xyn5-gfp,电转化至毕赤酵母GS115中得到表达木聚糖酶和绿色荧光蛋白的毕赤酵母SG菌株。该菌株经过常压室温等离子体诱变后进行单细胞液滴包埋,液滴培养24h后进行微流控筛选,获得高表达木聚糖酶的突变菌株,进而用于下一轮的诱变突变库构建和筛选。以此类推,经过5轮液滴微流控筛选,获得一株高产菌株SG-m5,其木聚糖酶活为149.17U/mg,较出发菌株提升300%,分泌外源蛋白的能力较出发菌株提高160%。文中建立的毕赤酵母单细胞液滴微流控高通量筛选方法能达到每小时10万菌株的筛选通量,筛选百万级别的菌株库仅需10h,消耗荧光试剂体积100μL,对比传统的微孔板筛选方法降低试剂成本近百万倍,为高效、低成本筛选获得表达和分泌外源蛋白能力提高的毕赤酵母提供了一条新途径。     

重组巴斯德毕赤酵母产米根霉α-淀粉酶发酵条件的研究

为了提高重组菌的淀粉酶表达量,以可分泌表达米根霉α-淀粉酶的甲醇快速利用型巴斯德毕赤酵母重组菌为基础,采用摇瓶发酵方式对影响重组菌表达淀粉酶的多个因素进行了研究和优化。摇瓶发酵条件确定为:温度为30℃,pH值为6.0,接种量为2.0(OD_(600)),甲醇补加方式采用前72 h发酵时间内每隔12h添加至终浓度为1.0%,72 h以后每隔24 h添加至终浓度为1.0%,在此条件下获得的淀粉酶最高表达量为47.5 U/mL,且在无机盐培养基中和有机氮源培养基中获得的淀粉酶发酵单位相当。以摇瓶发酵数据为基础确定15 L发酵罐放大实验条件为:无机盐培养基,温度为30℃,pH值为6.0,接种量为10%,甲醇流加方式采用DO—Start法控制,在此发酵条件下获得的淀粉酶表达量为440 U/mL,约为摇瓶发酵方式获得的淀粉酶表达量的9倍。     

快速筛选高效表达重组蛋白毕赤酵母菌株新方法的建立及评价

毕赤酵母是当前应用最为广泛的重组蛋白表达系统之一,文中建立了一种快速筛选高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株的新方法.首先,对内质网转膜蛋白Sec63融合表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的改造菌株GS115-E表达重组蛋白的能力进行检测;之后将携带不同拷贝数的植酸酶phy基因或木聚糖酶xyn基因的质粒转化进入GS115-E中,...     

An alpha-amylase inhibitor gene from Phaseolus coccineus encodes a protein with potential for control of coffee berry borer (Hypothenemus hampei)

Plant alpha-amylase inhibitors are proteins found in several plants, and play a key role in natural defenses. In this study, a gene encoding an alpha-amylase inhibitor, named alphaAI-Pc1, was isolated from cotyledons of Phaseolus coccineus. This inhibitor has an enhanced primary structure to P. vulgaris alpha-amylase inhibitors (alpha-AI1 and alpha-AI2). The alphaAI-Pc1 gene, constructed with the PHA-L phytohemaglutinin promoter, was introduced into tobacco plants, with its expression in regenerated (T0) and progeny (T1) transformant plants monitored by PCR amplification, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunoblot analysis, respectively. Seed protein extracts from selected transformants reacted positively with a polyclonal antibody raised against alphaAI-1, while no reaction was observed with untransformed tobacco plants. Immunological assays showed that the alphaAI-Pc1 gene product represented up to 0.05% of total soluble proteins in T0 plants seeds. Furthermore, recombinant alphaAI-Pc1 expressed in tobacco plants was able to inhibit 65% of digestive H. hampei alpha-amylases. The data herein suggest that the protein encoded by the alphaAI-Pc1 gene has potential to be introduced into coffee plants in order to increase their resistance to the coffee berry borer.     

提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展

巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统 ,与现有的其它表达系统相比 ,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。外源基因在该系统中表达时 ,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的 pH值等诸多因素的影响 ,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低 ,甚至不表达的情况。对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析 ,结合具体实践经验 ,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。     

重组人载脂蛋白A-Ⅰ在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高表达

高密度脂蛋白(High-density Lipoprotein,HDL)是血浆中重要的脂蛋白,其主要成分为载脂蛋白AⅠ(Apoliprotein AⅠ,ApoAⅠ为了大量制备该蛋白,首先尝试利用Pichia pastoris表达系统高效表达ApoAⅠ。通过PCR扩增获得天然含人载脂蛋白ApoAⅠ的基因片段,将其插入到P．pastoris分泌型载体pPIC9K上,BglⅡ酶切线性化后电转化P．pastoris GS115,将获得的1000多个转化子依次在含不同G418浓度的YPD平板筛选高抗性转化子,得到的22个高抗性转化子经甲醇诱导,SDS-PAGE检测得到6株高表达菌。然后对其中的高表达菌株AP16的培养及诱导条件进行了优化,结果显示：接种后培养24～28h,转入诱导阶段,培养基pH值在7—7．5,菌体密度OD600=80左右,以1％甲醇诱导96h最有利于ApoAⅠ的表达,表达水平达160mg／L。14L发酵罐结果显示表达水平与摇瓶相当,均高于其它表达系统,为大批量制备奠定了基础。     

Rice Bifunctional α-Amylase/Subtilisin Inhibitor: Cloning and Characterization of the Recombinant Inhibitor Expressed in Escherichia coli

The complete nucleotide sequences of the cDNA and its gene that encode a bifunctional α-amylase/subtilisin inhibitor of rice (Oryza sativa L.) (RASI) were analyzed. RASI cDNA (939 bp) encoded a 200-residue polypeptide with a molecular mass of 21,417 Da, including a signal peptide of 22 amino acids. Sequence comparison and phylogenetic analysis showed that RASI is closely related to α-amylase/subtilisin inhibitors from barley and wheat. RASI was found to be expressed only in seeds, suggesting that it has a seed-specific function. A coding region of RASI cDNA without the signal peptide was introduced into Escherichia coli and was expressed as a His-tagged protein. Recombinant RASI was purified to homogeneity in a single step by Ni-chelating affinity column chromatography and characterized to elucidate the target enzyme. The recombinant inhibitor had strong inhibitory activity toward subtilisin, with an equimolar relationship, comparable with that of native RASI, and weak inhibitory activity toward some microbial α-amylases, but not toward animal or insect α-amylases. These results suggest that RASI might function in the defense of the seed against microorganisms.     

Expression of human serum albumin in methylotrophic yeast Pichia pastoris and its structural and functional analysis

The stable strain of methylotrophic yeast Pichia pastoris secreting human serum albumin into cultural medium was obtained. Optimal conditions for expression of the protein were determined. We characterized the recombinant protein by mass spectrometry and circular dichroism and analyzed its catalytic activity.     

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达

目的:比较PichiaPink表达系统和巴斯德毕赤酵母GS115在表达外源蛋白方面的差异,对PichiaPink表达系统的潜在优点进行评价。方法:以重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)为报告蛋白,构建相关载体,分别转化PichiaPink系统菌株和巴斯德毕赤酵母GS115菌株,诱导HSA-IFN-α2b表达并测定表达水平;通过SDS-PAGE检测HSA-IFN-α2b在PichiaPink系统中的降解程度。结果:PichiaPink系统几乎所有的转化子都可以表达HSA-IFN-α2b,而GS115菌株只有60%的转化子能表达HSA-IFN-α2b;同一种Pink菌株中,整合有高拷贝数表达载体pPink-HC的菌株表达量高于整合有低拷贝数表达载体pPink-LC的菌株;Pink蛋白酶缺陷菌株在复杂培养基(YPD,BMMY)中HSA-IFN-α2b基本没有降解,而在合成培养基(BSM)中降解现象明显。结论:PichiaPink表达系统产生的转化子较GS115菌株产生的转化子易于筛选;PichiaPink系统蛋白酶缺陷菌株可明显减少外源蛋白降解。这些结果为利用PichiaPink表达系统高水平和大规模制备外源蛋白提供了实验依据。     

重组人卵透明带ZP3蛋白在毕赤酵母中的表达

利用P.pastoris表达人卵透明带ZP3蛋白。设计特定引物从全长hZP3 cDNA上扩增含跨膜区序列的人卵透明带ZP3基因片段,并在N末端接上串联组氨酸编码序列的重组基因序列;扩增片段插入表达载体pPIC9K中;线性化后的重组质粒转入P.pastoris中,用高浓度G418筛选高拷贝菌株,然后甲醇诱导目的蛋白表达。用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。结果发现P.pastoris表达的人ZP3蛋白可以分泌到培养液中,并且可溶性好。纯化前后的重组人ZP3蛋白均能与兔抗猪ZP3蛋白抗体发生交叉反应,证实表达的目的蛋白具有反应原性。