人类腺病毒载体疫苗及其免疫研究进展与展望

复制性和非复制性重组人类腺病毒（Ａｄ）活载体口服疫苗的开发使用是十多年来疫苗研究领域的一项重大突破。目前国际上倾向于以Ａｄ为表达载体发展多价重组口服活疫苗,尤其在艾滋病、乙型肝炎、狂犬病、单纯疮疹病毒疫苗研制上成效显著,共表达ＨＢｃＡｇ／ＨＢｅＡｇ和ＨＢｓＡｇ或共表达ＨＩＶ-１ｒｅｖ和ｇａｇ多肽的重组Ａｄ７活载体疫苗在实验动物免疫上取得良好效果,共表达狂犬病毒糖蛋白、核蛋白及微小磷蛋白的重组Ａｄ活载体口服疫苗应及时研制,安全有效的重组Ａｄ载体疫苗乃至全价、多型、多联疫苗必将大量推出并成功地得到临床应用。非复制性重组Ａｄ活载体在疫苗制备及某因防治上具有很大的潜在应用价值,应当深入研究。     

不同DNA疫苗联合接种可有效增强免疫效果

造反乙型肝炎（乙肝）病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇＡ）、ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）及单纯疱疹病毒ｇＤ抗原（ＨＳＶ－１－ｇＤ）基因为目的基因,进行ＤＮＡ疫苗联合免疫的研究。通过对不同基因片段的表达研究,选择了能在哺乳动物细胞中高效表达乙肝病毒核心抗原、ｅ抗原和单纯疱疹病毒ｇＤ抗原的质粒ＤＮＡ免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠。结果显示：表达乙肝病毒核心抗原和单纯疱毒ｇＤ抗原的ＤＨＡ疫苗单独免疫,能有效刺激机体产生体液免疫和细     

乙肝基因疫苗在BALB/c小鼠体内的效力评价

采用ＨＢｓＡｇ高表达细胞株（ＣＨＯ－Ｃ２８）试制的乙肝基因疫苗,对ＢＡＬＢ／ｃ小鼠进行免疫,四周后进行了血清效力评价。并同时与血源乙肝疫苗进行了比较。结果表明,乙肝基因疫苗能达到与乙肝血源疫苗相同的免疫效果。     

脂质体化r-HBsAg的研究

用逆相蒸发技术制备带不同表面电荷的脂质体及脂质体化的重组乙肝基因工程疫苗（ｒ－ＨＢｓＡｇ）。制备的脂质体平均粒径为１５０－４５０ｎｍ,不同电荷脂质对粒径无明显影响,加入ｒ－ＨＢｓＡｇ使粒径略有增大。ｒ－ＨＢｓＡｇ包裹率为４４－５７％,不同电荷脂质体间无明显差异。荧光染料Ｃａｌｃｅｉｎ包裹率为３－７％,明显低于ｒ－ＨＢｓＡｇ的包裹率。用准弹性光散射（ｑｕａｓｉ－ｅｌａｓｔｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ,ＱＥＬＳ）技术测定脂质体的泳动速率,加入ｒ－ＨＢｓＡｇ及新型免疫佐剂ＡＳＤ系列后,对脂质体的泳动速率有明显影响。     

用杆状病毒载体在家蚕细胞中表达HBeAg基因

以ＰＣＲ技术扩增含有ＰｒｅＣ信号肽序列及完整的ＨＢｅＡｇ基因的序列（即ＨＢｃＡｇ基因５′端４４７ｂｐ）,在５′端加上合适的酶切位点,克隆到家蚕核多角体病毒转移载体ｐＢｍ０３０上,与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,空斑纯化后得到多角体基因失活的重组病毒。ＥＬＩＳＡ法测定表明培养液上清中ＨＢｅＡｇ效价达１∶３２０００,细胞内ＨＢｅＡｇ效价为１∶２０００,培养液及细胞内的ＨＢｃＡｇ含量极低（＜１∶１６０）。研究结果表明,ＢｍＮ细胞能正确识别与切割ＨＢｅＡｇ信号肽序列,所表达的ＨＢｅＡｇ效价高,纯度好,明显优于大肠杆菌表达系统     

乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)感染是我国常见病及多发病。ＨＢＶ难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍。目前虽然基因重组ＨＢＶ表面抗原 (ＨＢｓＡｇ)疫苗预防ＨＢＶ感染取得了较好的效果 ,但基因重组ＨＢｓＡｇ疫苗主要能诱导特异性体液免疫 ,不能刺激机体的细胞免疫应答。近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应 ,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗 ,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2 ] 。为了探讨应用ＨＢＶ基因疫苗预防ＨＢＶ感染的可能性 ,本文构建了ＨＢＶ全Ｓ基因和ＨＢｓＡｇ基因疫苗 ,观察和比…     

HCV/HBV复合抗原基因的克隆、表达及免疫应答研究

为探讨ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合疫苗的可行性,将合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）复合多表位抗原基因ＰＣＸ与ＨＢｓＡｇ 基因连接成ＰＣＸＳ基因,与β－半乳糖苷酶（ＧＺ）基因融合后在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得表达．目的蛋白ＧＺ－ＰＣＸＳ可被抗－ＨＢｓ 及抗－ＨＣＶ 抗体所特异识别．ＧＺ－ＰＣＸＳ抗原皮下注射免疫ＩＣＲ小鼠后,诱发了较高水平的抗－ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲ／ＰＣＸＳ）口服免疫小鼠后,诱发了高水平的ＣＤ８＋ Ｔ细胞增殖反应及抗ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．所有免疫小鼠均未见明显的毒副作用．该研究揭示,ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合抗原可诱发特异性体液免疫及细胞免疫应答,而活菌苗口服可能是理想的免疫途径,为ＨＣＶ／ＨＢＶ 双价疫苗研究提供了一定的理论及实验依据．     

酵母生产的HBsAg的化学结构及其免疫原性

酵母生产的ＨＢｓＡｇ的化学结构及其免疫原性汪恩浩（深圳康泰生物制品有限公司深圳,５１８０５７）用重组ＤＮＡ技术生产有用蛋白质,不仅要求多肽应正确表达,而且多肽应有正确的三维结构。对于多聚体蛋白,如干扰素、胰岛素、免疫球蛋白、乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）等,其三维结构通过链间和链内二硫键维持。虽然重组酵母细胞可以忠实地表达ＨＢｓＡｇ,酵母生产和纯化后的ＨＢｓＡｇ具有２０ｎｍ颗粒形式,但其中的亚单位是通过非共价键结合在一起,其免疫原性很差。     

糖基化对乙型肝炎表面抗原疫苗的影响

哺乳动物（ＣＨＯ）细胞表达的三种糖基化程度不同的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ａ（含ＧＰ３０,ＧＰ２７,Ｐ２３）,Ｂ（含ＧＰ２７及Ｐ２３）,Ｃ（只有Ｐ２３）,在免疫原性、放置后抗原的稳定性以及对不同单克隆抗体亲和力等方面都有明显的差异;（１）免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后血清中抗体工（ＥＤ５０）。平均结果为Ａ＝１：８０,Ｂ＝１：１１７,Ｃ＝１：１４,表明有糖基的ＨＢｓＡｇ疫苗对小鼠的免疫力明显高于无糖基的ＨＢ     

基因工程乙肝病毒表面抗原纯化工艺研究

基因工程乙肝病毒表面抗原（ｒＨＢｓＡｇ）是由重组哺乳动物细胞ＣＨＯ系分泌表达的,经过纯化制备基因工程乙肝疫苗。目前在国际上,对从ＣＨＯ细胞培养液中分泌的ｒＨＢｓＡｇ,纯化工艺主要采用多步柱层析和超滤技术,而在国内,ＣＨＯ系ｒＨＢｓＡｇ的大规模生...     

家蚕BmN细胞的微载体培养及HBeAg的高效表达

选择微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３对家蚕ＢｍＮ（从ＳｉｌｋｗｏｒｍＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ获得的细胞系）细胞进行高密度培养,并获得成功。观察了家蚕ＢｍＮ细胞在微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３上的贴壁分布,研究了不同接种浓度与微载体浓度时细胞的生长情况,并筛选出最佳的技术参数。在１０００ｍＬ滚瓶中用微载体Ｇｙｔｏｄｅｘ３培养家蚕细胞,在合适的培养条件下（细胞接种浓度３．６×１０５细胞／ｍＬ、微载体浓度５ｇ／Ｌ）,５ｄ后,细胞的终密度达到２．８×１０６细胞／ｍＬ,细胞增长指数为７．９。在细胞指数生长期（传代后４８～６０ｈ）用载有ＨＢｅＡｇ基因的重组病毒（ｒＢｍＨＢｅ）接种（感染量为０．４ＰＦＵ／细胞）,５ｄ后,培养上清中ＨＢｅＡｇ滴度为１∶９．６×１０４,是用方瓶静止培养的家蚕细胞表达量的３倍。     

乙型肝炎病毒重组腺病毒载体疫苗的构建及发展前景

人类腺病毒基因组Ｅ１区,Ｅ３区及介于Ｅ４区和右侧端插入性末端重复之间的区段存在插入位点,可供插入乙型肝炎病毒保护生免疫原基因,构建重组载体疫苗,本文就Ａｄ基因组分区段阐述了各类ＨＢＶ重组Ａｄ表达戴本构建的一般原则,并指出了辅助细胞依赖性缺陷型Ａｄ载体用作非复制性Ａｄ载体活疫苗的潜力及非缺陷型Ａｄ双表达载体用作复制性Ａｄ载体活疫苗的前景。     

PELA微球乙型肝炎疫苗的免疫原性研究

将疫苗包裹在可生物降解的微球中则一种极有潜力的新型疫苗载体系统。用聚－ＤＬ－乳酸－聚乙二醇共聚物（ＰＥＬＡ０为材料,包裹乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ０,缓释微球疫苗,以皮下注射或口服的方式免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,研究其免疫原笥。同时以乙肝常规铝佐剂疫苗免疫两剂作为对照。结果表明,皮下注射单剂微球疫苗后,在第１４周,小鼠血清ＩｇＧ滴度可达到与铝佐剂疫苗组相当的水平,维持较高的滴度;此外,口服微球疫苗组     

幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆、表达及免疫原性研究

幽门螺杆菌的感染可诱发人体产生胃炎和消化性溃疡,其组成成分热休克蛋白Ａ（ＨｓｐＡ）可刺激机体产生保护性的免疫反应。用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌的染色体ＤＮＡ上扩增出ＨｓｐＡ基因片段,将其插入原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中,并在ＢＬ２１（ＤＥ３）大肠杆菌表达。经测序ＨｓｐＡ基因片段有３５４ｂｐ组成,可编码１１８个氨基酸残基的多肽。ＳＤＳＰＡＧＥ和免疫印迹分析检测发现,ＨｓｐＡ基因表达的蛋白质分子量约为１５ｋＤ,并证实该重组蛋白质可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别,同时将其免疫小鼠可刺激机体产生抗该重组蛋白质的抗体。ＨｓｐＡ有可能作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗。     

30L生物反应器连续灌注培养重组CHO—C28细胞表达HBsAg的研究

应用３０ Ｌ生物反应器和微载体悬浮 培养技术,通过电脑全自动控制,连续灌注培养分泌ＨＢｓＡｇ 的重组ＣＨＯ－Ｃ２８细胞。试验了培养方式、连续灌流速度,反应器转速和细胞对葡萄糖消耗等工艺条件。观察培养６０ 天,细胞的生长形态、ＨＢｓＡｇ 分泌动态和染色体数。研究结果表明,连续培养６０ 天,细胞密度可达７．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌ,平均维持在（５．０～６．０）×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌ,收液的ＲＰＨＡ 滴度可达１∶５１２,ＨＢｓＡｇ 每天平均产量为３０ ｍ ｇ。     

少年人群接种乙肝疫苗后七年随访观察

对７９名ＨＢＶ标志阴性少年人群,以乙肝疫苗１０μｇ×３的免疫剂量和０、１、２月的免疫程序进行接种,对其抗－ＨＢｓ免疫应答和临床保护效果作了为期７年的定人随访。结果表明,抗－ＨＢｓ阳转率在免后三个月时为１００％,均值为３０８４ＭＩＵ／ｍｌ。至免后８４个月时疫苗接受者中仍有５５．７％的抗－ＨＢｓ水平≥１０ＭＩＵ／ｍｌ。６例检出抗－ＨＢｓ,其中５例的抗－ＨＢｓ持续处于高水平。全部观察对象无一例检出ＨＢｓＡｇ或发生临床肝炎。少年接种乙肝血源疫苗至少７年内可具有保护性抗体。故在此期内不需加强免疫。     

乙型肝炎、肝硬变和肝癌中HBxAg的表达及其在肝癌发生中的作用

对３７９例良、恶性肝组织进行的免疫组织化学研究显示,３３％的慢性迁延性肝炎（６／１８）、７６％的慢性活动性肝炎（２６／３４）、９２％的肝硬变（５７／６２）和９７％的肝细胞性肝癌（ＨＣＣ）（５８／６０）中有ＨＢｘＡｇ表达,阳性率高于ＨＢｓＡｇ或ＨＢｃＡｇ。癌周肝中的ＨＢｘＡｇ阳性率显著高于非癌周肝。与其它２种ＨＢＶ抗原不同,ＨＢｘＡｇ表达在细胞类型上有较明显的选择性,在肝小多角细胞（ＳＰＬＣ）、小细胞性不典型增生（ＳＣＤ）及ＨＣＣ中较强。与ＩＧＦⅡ、ｃ－ｅｒｂＢ－２、ｃ－ｍｙｃ和ＥＧＦ－Ｒ表达进行的对照研究表明ＨＢｘＡｇ与ＩＧＦⅡ和ｃ－ｅｒｂＢ－２这２种ＨＣＣ发生相关基因的表达关系密切。ＰＣＮＡ染色结果显示ＨＢｘＡｇ阳性组织的细胞增殖活性显著高于ＨＢｘＡｇ阴性组织。我们的结果还表明ＨＢｘＡｇ表达与肝细胞不典型增生的发生和进展有关、提出ＨＢＶＸ基因可能通过其表达产物（ＨＢｘＡｇ）首先激活ＩＧＦⅡ、ｃ－ｅｒｂＢ－２基因,继而引起显著的ＳＰＬＣ增生和ＳＣＤ而参与ＨＣＣ发生的．     

核酸免疫可特异地诱发小鼠对乙型肝炎病毒表面抗原S+PreS1免疫反应

运用改造后的乙型肝炎病毒表面抗原Ｓ＋ＰｒｅＳ１融合基因（将ＰｒｅＳ１区肝细胞受体结合位点（２１－４７ａａ）编码基因融合到Ｓ蛋白Ｃ端２２３位残基下游）,构建了一系列真核表达载体,并在ＣＨＯ细胞上有效表达了分泌型的、具有Ｓ＋ＰｒｅＳ１双重抗原性的融合蛋白颗粒。用上述质粒ＤＮＡ肌肉免疫Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠,成功地检测到了抗－ＨＢｓ和抗－ＰｒｅＳ１抗体,加强免疫能显著改善免疫效果。本研究还建立了检测抗－ＰｒｅＳ１的竞争抑制法和羊抗人ＨＢｓＡｇ封闭法,两种方法符合率达９６％,但后者更为敏感。用羊抗人ＨＢｓＡｇ封闭法测得抗－ＰｒｅＳ１滴度最高可达１：１２８０以上。     

抗乙肝病毒表面抗原嵌合抗体基因在昆虫细胞中的表达

应用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）人－鼠嵌合抗体重,轻链基因,鼠源单克隆抗体ＯＨ３重,轻链可变区（ＶＨ,ＶＬ）ｃＤＮＡ分别与人免疫球蛋白恒区γ３,ｋ,ｃＤＮＡ拼接成人－鼠嵌合抗体基因,含嵌合抗体的转移载体与线性化病毒ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,并通过点杂交ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析获得重组病毒。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和竞争ＥＬＩＳＡ表明以重组病毒感染的     

乙型肝炎病毒表面抗原aa126 Ile→Ser变异株HBsAg的暂时表达和抗原性鉴定

曾在一个儿童患者体内,发现一个新的乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）变异株,其ＨＢｓＡｇ主蛋白ａａ１２６发生Ｉｌｅ（ＡＴＴ）到Ｓｅｒ（ＡＧＴ）的取代。已知ａｄｒ／ａｙｒ亚型ＨＢｓＡｇ１２６位为Ｉｌｅ,而ａｄｗ／ａｙｗ亚型ＨＢｓＡｇ１２６位为Ｔｈｒ,表明ＨＢｓＡｇ１２６Ｓｅｒ是一个新的变异株。用计算机做结构分析的结果表明,突变体ＨＢｓＡｇ１２６Ｓｅｒ主蛋白ａａ１２０－ａａ１３０区段的二级结构与野生型ａｄｒＨＢＶＨＢｓＡｇ１２６Ｉｌｅ相比发生明显的改变。这种构象的变化可能会影响ａ抗原决定簇（ａ１２４－ａａ１４７）的抗原性。为了证实这一点,构建了突变Ｓ基因表达质粒,在ＳＶ４０早期启动子的控制下进行抗原表达。利用ＨＢｓＡｇ９肽（Ｔｈｒ－Ｉｌｅ１２６－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ）抗ｉ单克隆抗体和９肽（Ｔｈｒ－Ｔｈｒ１２６－Ｐｒｏ－Ａｌａ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｍｅｔ）抗ｔ单克隆抗体进行放射免疫测定,结果表明,这种Ｓｅｒ１２６突变蛋白对抗ｉ单克隆抗体的反应性比野生蛋白减弱,对抗ｔ单克隆抗体的反应性则与ＨＢｓＡｇ１２６Ｔｈｒ接近。但用三种抗－ａ单克隆抗体的检测结果揭示,突变蛋白ＨＢｓＡｇ１２６