SARS病毒N蛋白的原核重组载体的构建和表达

将SARS病毒N蛋白的基因克隆到原核表达载体 pGEX KG上 ,使其在大肠杆菌DH5α菌株中以与GST蛋白融合的形式表达。采用GluthathionSepharose 4B亲和层析柱对融合蛋白进行纯化 ,并用SDS PAGE和WesternBlot对表达的融合蛋白进行分析鉴定。结果表明 ,本实验成功地构建了高效表达SARS病毒N蛋白的重组表达载体 ,所获得的融合蛋白可以直接用于SARS抗体的检测 ,可用于SARS的早期诊断及SARS疫苗的研究。     

siRNA表达载体的构建及其表达

本研究用限制性内切酶消化质粒pCMV-tag-2B,除去巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子核苷酸序列,剩下的核苷酸序列作为构建表达siRNA(Smallinterfering RNA,siRNA)载体的前体.依据文献提供的扩增H1 RNA启动子核苷酸序列的引物序列合成一对引物,以带有H1 RNA启动子序列的质粒DNA为模板扩增H1RNA启动子序列,插入前体,构建SiRNA的表达载体pCH1.另外将H1 RNA启动子插入pGEM-11fz相应位点,构建瞬时表达载体pGH1.依据EGFP的有效SiRNA抑制位点,合成两条分别为64bp的核苷酸链,通过体外退火,形成双链,然后插入已构建的两个表达载体.将这两个载体分别与表达EGFP蛋白的质粒pEGFP-N3共转染Bel-7402细胞,观察siRNA对EGFP的抑制效应.研究结果表明构建的载体有效表达了siRNA,这些载体可以用于与siRNA相关抗病毒治疗性试验研究.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因截短体的克隆与原核表达

禽流感病毒H5N1 NS1蛋白是一种非结构蛋白,在病毒感染过程中发挥着重要的作用.构建基因截短的重组蛋白,可为进一步研究NS1不同结构域与宿主蛋白间的相互作用奠定基础.在成功克隆禽流感病毒H5N1全长NS1基因并测序的基础上,将部分截短基因序列克隆到表达栽体pET28a(+)上,构建基因截短的重组表达质粒pET28a-NS1-RBD和pET28a-NS1-ED,转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性重组质粒经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,然后利用Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对重组蛋白进行纯化,并通过Western Blotting进一步确认NS1及截短体蛋白的表达.结果表明,实验成功构建禽流感病毒H5N1亚型的NS1蛋白截短体,并在大肠埃希菌中高效表达,这为进一步研究NS1蛋白不同结构域与宿主蛋白的相互作用提供了实验材料,为深入研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

HBx蛋白与Hepsin共表达可促进HBV复制

运用RT-PCR技术从原发性肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)患者的癌旁组织中扩增了Hepsin基因编码区序列,该序列已被克隆并构建了pCMV-tag-HS表达质粒.将pCMV-tag-HS表达质粒和表达HBx蛋白的载体共转染HepG2.2.1.5细胞,观察HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用对HBV病毒复制和病毒蛋白表达的影响.研究结果表明共表达HBx蛋白、Hepsin蛋白可以协同提高HBV病毒颗粒在培养液中的拷贝数,并提高HBV病毒蛋白HBs、HBe的表达水平.这说明HBx蛋白和Hepsin蛋白相互作用可以增强HBV病毒的复制.     

杆状病毒的垂直传播及绿色荧光蛋白在棉铃虫幼虫中的表达

用转座穿梭系统构建了携带绿色荧光蛋白基因（gfp）的重组棉铃虫核型多角体病毒rHa-FGP,以其多角体添食感染棉铃虫3龄幼虫,室内饲养3代,各代均可见自然光下发绿色荧光的棉铃虫幼虫,其中子代不再重复感染。F₀、F₁、F₂代发绿色荧光的棉铃虫幼虫所占百分比分别为34%、20%、8%。提取虫体内的病毒多角体DNA,以PCR和斑点杂交鉴定表明,gfp不仅在亲代棉铃虫体内正常表达,而且在子代幼虫中表达,HaNPV通过卵实现了垂直传播。     

杆状病毒凋亡抑制基因的稳定转化及抗凋亡昆虫细胞系的构建

构建了新霉素抗性基因为筛选标记的带有凋亡抑制基因p35的重组质粒p35IE1Neo, 转化Sf9细胞后, 经G418筛选得到含有p35IE1Neo的Sf9细胞, 克隆化培养后命名为Sf9-35。PCR检测表明, Sf9-35细胞的染色体DNA上有p35基因的扩增带。经放线菌素D处理后的细胞核酸电泳和TdT介导bio-DUTP缺口末端标记(TUNEL)试剂盒检测, 证实Sf9-35具有抗凋亡特性。     

家蚕BmN细胞的微载体培养及HBeAg的高效表达

选择微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３对家蚕ＢｍＮ（从ＳｉｌｋｗｏｒｍＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ获得的细胞系）细胞进行高密度培养,并获得成功。观察了家蚕ＢｍＮ细胞在微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３上的贴壁分布,研究了不同接种浓度与微载体浓度时细胞的生长情况,并筛选出最佳的技术参数。在１０００ｍＬ滚瓶中用微载体Ｇｙｔｏｄｅｘ３培养家蚕细胞,在合适的培养条件下（细胞接种浓度３．６×１０５细胞／ｍＬ、微载体浓度５ｇ／Ｌ）,５ｄ后,细胞的终密度达到２．８×１０６细胞／ｍＬ,细胞增长指数为７．９。在细胞指数生长期（传代后４８～６０ｈ）用载有ＨＢｅＡｇ基因的重组病毒（ｒＢｍＨＢｅ）接种（感染量为０．４ＰＦＵ／细胞）,５ｄ后,培养上清中ＨＢｅＡｇ滴度为１∶９．６×１０４,是用方瓶静止培养的家蚕细胞表达量的３倍。     

家蚕BmN铁微载体培养及HBeAg的高效表达

选择微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３对家蚕ＢｍＮ（从Ｓｉｌｉｗｏｒｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ获得的细胞系）细胞进行高密度培养,并获得成功。观察了家蚕ＢｍＮ细胞在微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３上的贴壁分布,研究了不同接种浓度与微载体浓度时细胞的生长情况,并筛选出最佳的技术参数。在１０００ｍＬ滚瓶中用微载体Ｇｙｔｏｄｅｘ３培养家蚕细胞,在合适的培养条件下（细胞接种浓度３．６×１０＾５细胞／ｍＬ、微载体浓度５ｇ／Ｌ）,５     

表达barnase基因的重组棉铃虫核型多角体病毒的构建及其杀虫活性研究

将含有 barnase基因与杆状病毒多角体基因 ( ph)的重组转座载体 p Fb- Bar在大肠杆菌中与含有棉铃虫核型多角体病毒 ( Ha NPV)的穿梭载体 Hanpvid转座并提取重组穿梭载体 DNA转染棉铃虫细胞 ,得到重组棉铃虫病毒 r Ha- Bar.其分子杂交证明 ,昆虫细胞中有 r Ha- Bar的 bar基因转录本存在 ,并能表达产生 33k D的多角体蛋白和 1 2 k D的 barnase.在平板上 ,barnase能降解RNA,出现清晰的降解圈 .r Ha- Bar对三龄棉铃虫幼虫的毒力比野生型 Ha NPV的 LD50 减少 2 0 % ,LT50 减少 30 % .用 barnase的拮抗基因 barstar构建了具有 Neo抗性、并能稳定表达 barstar的棉铃虫转化细胞 AM1 - NB.以携带 barnase基因的重组病毒 r Ha- Bar分别感染转化细胞和正常细胞 ,48h子代病毒在转化细胞中的产量比在正常细胞中高 2 3倍 ,72 h高 1 60倍 .     

SARS-CoV感染Vero E6细胞诱导细胞凋亡

为了确定SARS冠状病毒(SARS-CoV)感染Vero E6是否引起细胞凋亡,我们利用细胞DNA琼脂糖电泳,感染细胞的间接荧光染色和Hoechst 33258细胞核染色,以及流式细胞仪分析等方法证明了SARS-CoV感染的Vero E6具有典型的凋亡细胞学和生物化学特征.实验证明具有细胞凋亡特征的所有细胞均为处于感染晚期的细胞.表现明显细胞病变(CPE)的细胞大多已经出现核质凝缩或形成凋亡小体进入细胞凋亡的过程.可以断定SARS-CoV感染Vero E6细胞诱发了细胞凋亡.