重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)鉴别试验的方法研究

目的：建立重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)鉴别试验的方法。方法：取重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)以1：10比例加入lmol/L盐酸调节pH值,采用ELISA双抗体夹心法检测,同时设以氢氧化铝、未处理的重组乙型肝炎疫苗、狂犬疫苗、出血热疫苗,以及试剂盒的阴、阳性作为对照。结果：狂犬疫苗、出血热疫苗及氢氧化铝对照为阴性,直接检测重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)呈弱阳性,加入盐酸调节pH值后原倍样品呈弱阳性,10倍稀释后呈强阳性。采用该方法检测5批疫苗均呈强阳性。组内平行试验,组间重复试验。结论：将重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)调节pH值后10倍稀释,用ELISA双抗体夹心法检测呈阳性,而且稳定可靠,该方法可用于该疫苗的鉴别试验。     

重组CHO细胞HBsAg 纯化工艺的优化

目的：优化重组CHO细胞HBsAg纯化工艺。方法：由乙肝病毒S基因转化的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养收液,经初步提纯、密度梯度离心、凝胶过滤层析可得到HBsAg纯品。结果：通过凝胶过滤层析收取HBsAg活性峰,控制HBsAg活性峰的收量,并把HBsAg活性峰的下降段再收集起来重新层析,改进后可使HBsAg的总回收率达到60％以上,而且牛血清蛋白残余量达到10mg/ml以下,HBsAg纯度97％以上。结论：重组CHO细胞HBsAg纯化工艺改进后,使HBsAg在产量及质量上均有明显提高。     

在CHO-C28细胞大规模培养中提高收获次数及HBsAg的表达

目的：在CHO—C28细胞大规模培养过程中增加收获次数,延长细胞收获周期,提高HBeAg收获量。方法：采用15L转瓶培养CHO—C28细胞,分3组,对比观察不同小牛血清含量及pH值对细胞生长及HBeAg表达的影响,优化最佳培养条件。结果:三组比较,实验1组的收获次数最多,达25次以上,HBsAg的表达量最高,收液量最多：结论：优化了CHO—C28细胞的培养条件.     

含preS2免疫表位的HBsAg基因质粒的构建及表达

目的：应用表位设计构建高效表达乙型肝炎表面抗原含preS2免疫原位基因的真核表达质粒。方法：PCR法从慢性乙型肝炎患者血清中扩增和分离preS2 120-146表位和S基因片段,将两者融合并置于载体pcDNA3.1的巨细胞病（CMV）启动子作用之下,构建真核表达质粒pcDNA-S2S。序列分析和脂质体转染COS-7细胞瞬时表达鉴定。结果：序列测定结果表明插入序列与乙型肝炎病毒中国株全基因参照序列（adr亚型）一致,COS-7细胞瞬时表达鉴定实验中,ELISA检测到preS2-Ag和HBsAg的OD450分别为0.469和0.426。结论：应用表位设计成功地构建了含preS2免疫表位基因的重组质粒pcDNA-S2S所构建质粒能高效表达和分泌目的的蛋白。     

Matrex Cellufine Sulfate在重组HBsAg纯化中的应用

建立纯化重组CHO细胞HBsAg的新工艺。将含有HBsAg的重组CHO细胞培养收获液,采用Butyl S Sepharose疏水作用柱层析、Matrex Cellufine Sulfate亲和柱层析、Sepharose 4FF凝胶过滤柱层析进行纯化,得到HBsAg纯品,该HBsAg经检定合格。HBsAg回收率为72％。     

30L生物反应器连续灌注培养重组CHO—C28细胞表达HBsAg的研究

应用３０ Ｌ生物反应器和微载体悬浮 培养技术,通过电脑全自动控制,连续灌注培养分泌ＨＢｓＡｇ 的重组ＣＨＯ－Ｃ２８细胞。试验了培养方式、连续灌流速度,反应器转速和细胞对葡萄糖消耗等工艺条件。观察培养６０ 天,细胞的生长形态、ＨＢｓＡｇ 分泌动态和染色体数。研究结果表明,连续培养６０ 天,细胞密度可达７．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌ,平均维持在（５．０～６．０）×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍ ｌ,收液的ＲＰＨＡ 滴度可达１∶５１２,ＨＢｓＡｇ 每天平均产量为３０ ｍ ｇ。     

乙型肝炎卡介苗联合疫苗稳定性的研究

研究乙型肝炎卡介苗联合疫苗中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)组分的稳定性。将连续3批联合疫苗,分别放置于37、25、4℃三种温度条件下,并于1、2、3、6、12、18、24个月时间取样检测,采用ELISA方法检测HBsAg含量,研究不同条件下联合疫苗中HBsAg的变化和HBsAg组分的免疫原性。37、25℃条件下6个月,4℃条件下2a,HBsAg组份含量无明显变化,均在合格范围内。37℃放置1、6个月,4℃条件下放置2a的联合疫苗免疫豚鼠,HBsAg组分的免疫原性无明显变化。乙型肝炎卡介苗联合疫苗中HBsAg组分的稳定性良好,4℃条件下放置2a效力无明显下降。     

重组(CHO细胞)乙型肝炎疫苗细菌内毒素含量检测法的建立

采用鲎试剂法检测重组 (CHO细胞 )乙型肝炎疫苗中的细菌内毒素含量 ,研究了甲醛、硫柳汞、氢氧化铝等疫苗成分对鲎试剂试验的影响。结果表明 ,疫苗中各成分对检测未见影响 ,所以检测本疫苗中内毒素含量时 ,采用鲎试剂法是可行的。同时 ,用此试验方法对本室所生产的重组 (CHO细胞 )乙型肝炎疫苗进行了检测 ,疫苗中内毒素含量全部合格