密码子优化的人H5N1流感病毒HA基因在哺乳动物细胞中获得高效表达

为了提高人禽流感病毒血凝素HA的表达量,应对流感大流行疫苗的需求,按照人的偏爱密码子将H5N1(A/Anhui/1/2005)流感病毒的HA基因进行优化改造,经全基因合成后插人到真核表达载体pDC315中,构建了真核表达质粒pDC315-Mod.HA;将此质粒和含野生HA基因的真核表达质粒pDC315-Wt.HA分别转染293T细胞,比较HA蛋白的表达量.结果表明:经间接免疫荧光实验及Western blot实验比较和鉴定,密码子优化后,HA蛋白在293T细胞中的表达水平显著提高,为流感大流行疫苗的研究打下了基础.     

禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在真核酵母菌中的表达

目的:克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2血凝素基因(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶基因(neuramidinase,NA)序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法:在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMETA上,构建了重组表达质粒pMETA/HA(52～1545bp),pMETA/NA(121～1254bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果:重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示蛋白表达后形成了二聚体,蛋白纯度占总蛋白的95%以上,ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2HA、NA基因序列,为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

禽流感病毒H9N2血凝素基因和神经氨酸酶因在大肠杆菌中的表达

克隆、表达和鉴定禽流感病毒H9N2 HA,NA基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆禽流感病毒H9N2全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a(+)上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a(+)/HA(截短)、pET32a(+)/NA(截短)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱和GSTrap4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western Blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。ELISA和Western Blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。本研究成功克隆和表达了禽流感病毒H9N2 HA、NA基因序列。为禽流感病毒H9N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

甲型H5N1流感病毒M2与HA双基因载体疫苗在小鼠体内的免疫学评价

高致病性H5N1亚型禽流感病毒 (AIV) 严重威胁到人类健康,因此研制高效、安全的禽流感疫苗具有重要意义。以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 作为研究对象,PCR扩增基质蛋白2 (M2) 和血凝素 (HA) 基因全长开放阅读框片段,构建共表达H5N1亚型AIV膜蛋白基因 M2和HA的重组质粒pStar-M2/HA。此外,还通过同源重组以293细胞包装出表达M2基因的重组腺病毒Ad-M2以及表达HA基因的重组腺病毒Ad-HA。用间接免疫荧光 (IFA) 方法检测到了各载体上插入基因的表达。按初免-加强程序分别用重组质粒pStar-M2/HA和重组腺病毒Ad-HA+Ad-M2免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制 (HI) 实验检测到免疫后小鼠血清中的HI活性。ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒表面蛋白的IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M2蛋白和HA蛋白的特异性细胞免疫应答。流感病毒M2与HA双基因共免疫的研究,为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。     

禽流感病毒H5N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达

目的：克隆、表达和鉴定禽流感病毒H5N1血凝素基因（hemagglutinin,HA）和神经氨酸酶基因（neuramidinase,NA）序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法：在成功克隆禽流感病毒H5N1全长HA、NA基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pET32a（＋）上,全基因序列克隆到表达载体pGEX4T-1上,构建了重组表达质粒pET32a（＋）/HA(49~1587bp)、pET32a（＋）/NA(121~1141bp)、pGEX4T-1/HA、pGEX4T-1/NA,转化大肠杆菌BL21/rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱和GSTra P4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果：重组蛋白在大肠杆菌中可以高效达,SDS PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白纯度占总蛋白的90％以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。结论:成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 HA、NA基因序列,为禽流感病毒H5N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。     

H9N2亚型禽流感病毒M2e和HA2串联蛋白在原核系统中的表达

构建H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)和HA蛋白颈部区(HA2)串联体,并在原核系统中进行该重组蛋白的表达,以便研究重组蛋白的反应原性。以含有全长H9N2亚型AIV HA基因的质粒为模板,经过PCR扩增得到HA2基因;利用BglⅡ和Bam HⅠ互为同尾酶的链接方法,构建3个拷贝M2e和HA2基因的串联体,并将串联体连接入原核表达载体pGEX-4T-1构成3M2e+HA2-pGEX重组质粒;同时构建单独表达HA2蛋白的原核表达重组质粒HA2-pGEX;DNA测序鉴定这两种重组质粒正确后,转化至表达宿主菌中;重组蛋白经不同IPTG浓度进行诱导;SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,并进行可溶性分析和纯化;采用Western blotting法对两种重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.5 mmol/L和0.25 mmol/L的IPTG诱导,37℃培养4 h时,表达量最高;3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白大小分别为59.4 ku和49.8 ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,两种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blotting分析显示,3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白与免疫H9N2禽流感病毒后获得的阳性血清具有良好的特异性反应,这些结果为进一步研究HA2、3M2e+HA2蛋白的免疫原性和开发广谱H9N2亚型禽流感疫苗提供了理论依据。     

共表达甲型流感病毒M1和HA双基因的重组腺病毒的构建及鉴定

以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)作为研究对象,通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),构建共表达H5N1亚型禽流感病毒膜蛋白基因M1和HA的重组腺病毒。PCR扩增禽流感病毒H5N1亚型M1和HA基因的全长可读框片段,先后亚克隆入pStar载体,然后扩增M1-IRES-HA片段并将其插入穿梭载体pShuttle-CMV,再与pAd-Easy载体在BJ5183菌中通过同源重组产生重组腺病毒载体,转化293细胞,包装出重组腺病毒Ad-M1/HA。将Ad-M1/HA感染293细胞,可观察到明显细胞病变效应,用免疫荧光及Western-blot方法均检测到M1和HA基因的表达。共表达M1和HA双基因的重组腺病毒的成功构建为开发新型重组腺病毒流感疫苗奠定了基础。     

人H5N1流感病毒血凝素蛋白DNA疫苗的构建及其免疫原性研究

将我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和HA1基因片段并克隆至真核表达载体pStar,构建成真核表达质粒。通过Western blot和间接免疫荧光检测方法确认,构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和HA1。将重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测免疫后外周血中HA/HA1特异性抗体的效价,并比较HA和HA1的免疫原性。结果表明,重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应,且二者的血清抗体效价无显著性差异。     

禽流感抗原基因NA,HA的克隆及其表达载体的构建

HA和NA是禽流感病毒重要的保护性抗原基因,为了得到禽流感植物疫苗,本试验采用高保真PCR扩增方法得到目的基因,分别克隆到pMD18-T载体.经测序证实核酸序列正确后,克隆到含有GUS基因的高效植物双元表达载体pB1121上,获得含有HA/NA基因的植物双元表达载体pB1121-HA和pB1121-NA,采用冻融法将含HA/NA基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌LBA4404,菌液浸染生菜子叶,共培48小时后进行GUS基因表达检测,x-glue染色显蓝色,说明带有HA/NA的植物双元表达载体构建成功,为下一步的生菜转HA/NA基因研究奠定基础.     

虎源流感病毒HA 基因的系统发生分析及其在杆状病毒系统中的表达

通过对虎源流感病毒A/ Tiger/ Harbin/01/ 2003 (H5N1)的HA 基因进行克隆与序列测定,证明该基因全长为1 731 bp,读码框由1 707个碱基组成,编码568 个氨基酸。对HA 基因的进化分析表明,该基因与H5 亚型流感病毒的HA 基因同源性最高,其HA 裂解位点由6 个碱性氨基酸插入序列(RRRKKR)组成,符合高致病性禽流感病毒的分子特征。将HA 基因克隆入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ,构建重组质粒pFastBac-HA;再将该重组质粒转化DH10 Bac 感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-HA;将Bacmid-HA 转染sf9 细胞,获得重组杆状病毒。经Western-blotting 检测,HA 蛋白在重组杆状病毒中获得表达。用感染重组病毒的sf9 细胞免疫小鼠,2 次免疫后2 周可诱导小鼠产生1∶ 8 ～1∶ 16 的血凝抑制抗体,表明虎源流感病毒的HA 基因在重组杆状病毒系统中得到了正确表达。     

重组虎源H5N1流感病毒HA基因犬2型腺病毒的构建与实验免疫研究

H5N1流感病毒可以对虎和猫产生致死性感染,为研制可用于预防猫科动物流感的新型疫苗,构建了重组虎源H5N1流感病毒HA基因的犬2型腺病毒。将A/Tiger/Harbin/01/2003(H5N1)的HA基因克隆入pVAX1载体中,然后将含有HA基因的表达盒(CMV HA PolyA)克隆入pVAXΔE3的SSPⅠ酶切缺失处,获得含有HA表达盒的穿梭载体pΔEHA。用SalⅠ NruⅠ分别对pΔEHA和pPoly-2-CAV2进行双酶切,将含有HA表达盒的SalⅠ NruⅠ片段克隆入pPoly2-CAV2,获得了在E3区缺失处插入HA表达盒的重组质粒pCAV-2/HA。释放CAV-2/HA重组基因组转染MDCK细胞,获得了重组活病毒CAV2/HA,经Western blot分析表明重组表达产物可被流感病毒HA单克隆抗体3A13所识别。使用该重组病毒免疫猫可以产生效价为1∶8~1∶16的抗H5亚型流感病毒血凝抑制抗体。     

Transient expression of hemagglutinin antigen from low pathogenic avian influenza A (H7N7) in Nicotiana benthamiana

The influenza A virus is of global concern for the poultry industry, especially the H5 and H7 subtypes as they have the potential to become highly pathogenic for poultry. In this study, the hemagglutinin (HA) of a low pathogenic avian influenza virus of the H7N7 subtype isolated from a Swedish mallard Anas platyrhynchos was sequenced, characterized and transiently expressed in Nicotiana benthamiana. Recently, plant expression systems have gained interest as an alternative for the production of vaccine antigens. To examine the possibility of expressing the HA protein in N. benthamiana, a cDNA fragment encoding the HA gene was synthesized de novo, modified with a Kozak sequence, a PR1a signal peptide, a C-terminal hexahistidine (6×His) tag, and an endoplasmic retention signal (SEKDEL). The construct was cloned into a Cowpea mosaic virus (CPMV)-based vector (pEAQ-HT) and the resulting pEAQ-HT-HA plasmid, along with a vector (pJL3:p19) containing the viral gene-silencing suppressor p19 from Tomato bushy stunt virus, was agro-infiltrated into N. benthamiana. The highest gene expression of recombinant plant-produced, uncleaved HA (rHA0), as measured by quantitative real-time PCR was detected at 6 days post infiltration (dpi). Guided by the gene expression profile, rHA0 protein was extracted at 6 dpi and subsequently purified utilizing the 6×His tag and immobilized metal ion adsorption chromatography. The yield was 0.2 g purified protein per kg fresh weight of leaves. Further molecular characterizations showed that the purified rHA0 protein was N-glycosylated and its identity confirmed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. In addition, the purified rHA0 exhibited hemagglutination and hemagglutination inhibition activity indicating that the rHA0 shares structural and functional properties with native HA protein of H7 influenza virus. Our results indicate that rHA0 maintained its native antigenicity and specificity, providing a good source of vaccine antigen to induce immune response in poultry species.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及其诱导肺腺癌细胞A549凋亡的研究

通过RT-PCR的方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并构建了真核表达载体pCMV-Myc/NS1。将此真核表达质粒转染肺腺癌细胞A549,48 h后,经Western印迹检测,NS1基因能在细胞中正确表达。经荧光显微镜、透射电镜观察和流式细胞仪检测,发现该株流感病毒的NS1蛋白可诱导肺腺癌细胞A549凋亡。