1株表现为鞭毛抗原3相的韦太夫雷登沙门氏菌的鉴定和基因组序列分析

利用高通量测序获取1株抗原式为3,10∶a,r,z6的沙门氏菌(Salmonella)GX150603的全基因组序列.根据鞭毛抗原序列、致病性和抗性基因预测GX150603的血清型,利用分子生物学软件分析基因组岛和前噬菌体,并与其他菌株进行全基因组系统发育分析.经鉴定GX150603为韦太夫雷登沙门氏菌(Salmonella enteric asubsp.enterica serovar Weltevreden),并推测由于鞭毛抗原的氨基酸变异导致该菌株与H∶a血清产生了交叉反应.GX150603基因组携带148个毒力相关基因,8个耐药相关基因,27个基因组岛和3个前噬菌体.基因组岛包括沙门氏菌毒力岛SPI-1/2/3/4/5/6/9/11/13/14/19,centisome 63,CS54和3个该血清型特有的基因组岛.与7个韦太夫雷登沙门氏菌欧洲分离株比较,GX150603有4个共线性片段重排,4个共线性片段缺失和1个共线性片段存在较大差异,进化分析显示,同一血清型仍然表现出最近的亲缘关系.     

SPF鸡肝脏细胞cDNA文库的构建及鉴定

旨在构建SPF鸡肝脏组织细胞的cDNA文库并且对文库质量进行鉴定。用TRIzol方法从SPF鸡肝脏组织细胞中提取总RNA,用紫外分光光度仪测定其含量后,应用SMART技术经过LD-PCR合成双链cDNA。利用CHROMA SPIN-400纯化柱纯化得到双链cDNA,并与线性pGADT7-Rec共转化进酵母Y187感受态,以同源重组的方式在酵母细胞内构建鸡肝脏酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,成功构建含有1.70×10~7个重组子的SPF鸡肝脏细胞cDNA文库,插入片段多数在0.4~2.0 kb之间,重组率达100%,重组子中平均插入的片段长度为1.0 kb,文库滴度为1.30×10~7 cfu/mL。结果表明,该文库达到了高质量文库所应具备的条件,为进一步筛选此文库与ARV相互作用的宿主蛋白以及研究其功能提供了数据依据。     

H9N2亚型禽流感病毒M2e和HA2串联蛋白在原核系统中的表达

构建H9N2亚型禽流感病毒M2蛋白胞外区(M2e)和HA蛋白颈部区(HA2)串联体,并在原核系统中进行该重组蛋白的表达,以便研究重组蛋白的反应原性。以含有全长H9N2亚型AIV HA基因的质粒为模板,经过PCR扩增得到HA2基因;利用BglⅡ和Bam HⅠ互为同尾酶的链接方法,构建3个拷贝M2e和HA2基因的串联体,并将串联体连接入原核表达载体pGEX-4T-1构成3M2e+HA2-pGEX重组质粒;同时构建单独表达HA2蛋白的原核表达重组质粒HA2-pGEX;DNA测序鉴定这两种重组质粒正确后,转化至表达宿主菌中;重组蛋白经不同IPTG浓度进行诱导;SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,并进行可溶性分析和纯化;采用Western blotting法对两种重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.5 mmol/L和0.25 mmol/L的IPTG诱导,37℃培养4 h时,表达量最高;3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白大小分别为59.4 ku和49.8 ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,两种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blotting分析显示,3M2e+HA2-pGEX和HA2-pGEX重组蛋白与免疫H9N2禽流感病毒后获得的阳性血清具有良好的特异性反应,这些结果为进一步研究HA2、3M2e+HA2蛋白的免疫原性和开发广谱H9N2亚型禽流感疫苗提供了理论依据。     

可视化牛支原体和传染性鼻气管炎二重荧光LAMP诊断方法的建立

牛支原体(mycoplasma bovis,MB)和牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)是引起牛呼吸综合症的主要病原体.本研究根据MB和IBRV的保守基因序列,设计并合成两套特异性LAMP引物,在每条内引物的5'端标记荧光基团,通过扩增产物的颜色判断检测结果,建立了用于检测MB和IBRV的二重荧光LAMP检测方法.该方法与其他牛病原体无交叉反应,检测敏感度达100拷贝/μL.应用该方法检测125份样品,MB的感染率为44.8％,IBRV的感染率为13.6％,2种病原混合感染率为1.6％;与OIE推荐的荧光定量PCR检测方法相比,此二重LAMP方法敏感性为94.4％～96.6％,特异性为100％.结果表明该方法灵敏度高,特异性好,重复性好,能同时检测大量样本,可用于MB和IBRV的临床检测和流行病学调查.