重组双功能水蛭素质量标准研究

以生色底物法测定抗凝血酶活性,比浊法测定抗血小板聚集活性,还原型SDS-PAGE测定分子量,SDS-PAGE和反相高效液相色谱测定纯度,毛细管电泳法测定等电点,胰蛋白酶酶切后进行肽图分析,其余检测项目按《中国药典》2005版三部规定进行。结果显示,用建立的方法对原液和成品进行了检定,各项指标均符合《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》和《中国药典》2005版三部的要求。建立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点,可用于重组双功能水蛭素产品的常规检定。     

重组定点突变巴曲酶质量标准研究

目的 建立重组定点突变巴曲酶的质控方法和质量标准.方法 生物学活性测定采用血浆凝集活性测定法;通过胰蛋白酶消化和RP-HPLC法分析该蛋白还原型肽图;其余检测项目均按<中华人民共和国药典>2010年版(三部)相关规定进行.结果 用建立的方法对三批重组定点突变巴曲酶原液和成品进行检定,各项指标均符合2010版<中华人民共和国药典>和相应指导原则的要求.三批原液比活性均≥2000 kU/mg.肽图三批次之间一致,原液的蛋白含量、纯度、分子质量、等电点、N末端氨基酸序列等指标均符合规定.结论 建立的质控方法可有效地控制重组定点突变巴曲酶产品质量,并可用于定点突变巴曲酶原液及成品的常规检定.     

EH-L-Fc在CHO细胞中的表达、纯化及活性分析

目的:为延长重组新蛭素(EH)的半衰期,制备通过连接肽连接的重组新蛭素与IgG1Fc的融合蛋白EH-LFc,并对其进行功能分析。方法:采用重叠PCR技术构建Eh-L-Fc融合基因,克隆至表达载体pcDNA3.1,用脂质体将重组表达载体转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,G418抗性筛选稳定克隆株;Western印迹检测培养上清中EH-LFc蛋白的表达,用有限稀释法对G418抗性筛选出的混合克隆单克隆化,通过Protein A亲和层析柱纯化融合蛋白,Lowry法检测蛋白浓度,SDS-PAGE、HPLC法检测目的蛋白纯度,质谱法分析相对分子质量,凝血因子Ⅹa裂解融合蛋白后采用纤维蛋白凝块法测定其抗凝活性。结果:构建了重组表达载体pcDNA3.1-Eh-L-Fc,并获得稳定表达EHL-Fc的细胞株。表达产物的相对分子质量为72 168,HPLC检测亲和层析获得的EH-L-Fc纯度达93.9%。完整的EH-L-Fc无抗凝活性,经凝血因子Ⅹa裂解后其抗凝比活性为96.6 ATU/mg。结论:获得稳定表达EH-L-Fc的CHO细胞株和较高纯度的重组融合蛋白,且该重组融合蛋白经凝血因子Ⅹa裂解后可释放抗凝活性。EH-L-Fc融合蛋白的获得为研究新蛭素的长效剂型奠定了重要基础。     

重组低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵工艺研究及其纯化与鉴定

目的:通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进,建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白(EH)的中试发酵工艺,为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法:首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线,然后根据生长曲线,将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后,直接接种到500 L的发酵罐中放大培养,通过发酵液的D600nm值、溶氧值(DO2)及菌体湿重动态监测细菌的生长状态,并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白;表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白;用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度;用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量;用Western印迹验证目的蛋白;用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果:发酵结束时,上清中蛋白含量达1.41 g/L,经后期分离纯化,得到约21 g EH蛋白,SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13.2×103±0.2×103,质谱分析相对分子质量约为7.3×103±0.73×103;Western印迹表明检测条带为目的蛋白,能被抗水蛭素抗体特异性结合;非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95%;凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512~1024 ATU/mg。结论:建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。     

A型肉毒神经毒素理化及生物学特性研究

目的探究A型肉毒神经毒素的理化及生物学特性,为A型肉毒神经毒素制品的研制提供依据。方法采用SDS-PAGE、HPLC测定A型肉毒神经毒素的纯度;采用毛细管凝胶电泳分析其在非还原条件及还原条件下各组分的相对分子质量;采用等电点聚焦电泳测定其等电点;对其N-末端氨基酸序列进行测序,并将测序结果与NCBI blast数据库中A型肉毒梭菌Hall株的氨基酸序列作比对,确证其各组分的成分;对A型肉毒毒素复合物及A型肉毒神经毒素进行口服毒性分析,并对3批A型肉毒神经毒素原液和其半成品进行生物学稳定性研究。结果 A型肉毒神经毒素纯度99.00%;非还原条件下其相对分子质量约为152 000,N-末端氨基酸序列ALNDLQINVN,为完整的A型肉毒神经毒素;还原条件下,由相对分子质量约为101 000、N-末端氨基酸序列为ALNDLQINVN的重链和相对分子质量约为101 000、N-末端氨基酸序列为PFVNKQFNYK的轻链组成;等电点为4.91;口服A型肉毒神经毒素的小鼠LD50为1.50×107U/kg,是其复合物的7.9倍;3批A型肉毒神经毒素原液在2~8℃放置28 d生物学活性无下降,平均比活性为2.13×108U/mg,是其复合物的7.1倍;3批半成品在18~26℃放置28 d生物学活性无下降。结论 A型肉毒神经毒素纯度较高,非还原条件下为单链,还原条件下裂解为轻链和重链,其原液及其半成品的生物学稳定性较好。     

津田芜菁MYB77蛋白的原核表达及纯化

目的:建立津田芜菁转录因子MYB77的原核表达系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:RT-PCR获得MYB77的编码序列,将其克隆至pGEM-T载体中,在上下游引物中分别引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,PCR获得带酶切位点的目的片段并将其连接到重组表达载体pGEX-KG中,转化大肠杆菌DE3工程菌株,IPTG诱导重组质粒pGEX-KG-MYB77在大肠杆菌DE3中表达带有GST标签的融合蛋白,超声裂解大肠杆菌,用MagneGST ProteinPurification System纯化目的蛋白,通过SDS-PAGE和Western印迹验证GST-MYB77融合蛋白的表达。结果:重组菌株可以表达GST-MYB77融合蛋白,用Western印迹鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量为55.56×103处检测到目的条带。结论:利用大肠杆菌表达系统获得了较高纯度的GST-MYB77融合蛋白,为进一步研究津田芜菁MYB77蛋白的功能奠定了基础。     

拟南芥SHORT-ROOT基因稀有密码子分析及其在原核细胞中的表达和纯化

目的:在大肠杆菌中重组表达拟南芥SHORT-ROOT(SHR)蛋白并纯化。方法:将SHR基因编码区克隆至p GEX-4T-2表达载体,构建重组质粒p GEX-4T-2-SHR并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),表达产物经谷胱甘肽亲和层析凝胶4B分离纯化,SDS-PAGE分析和Western印迹鉴定。结果:SHR融合蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的86×103,且经Western印迹确证。结论:获得了拟南芥SHR融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

注射用A型肉毒毒素的稳定性验证

目的验证注射用A型肉毒毒素(商品名:衡力)成品的稳定性。方法依据《中华人民共和国药典》2010版(三部)(简称《中国药典》)各论中注射用A型肉毒毒素成品检定标准,对注射用A型肉毒毒素成品进行稳定性长期试验(2~8℃)、加速试验(25±2)℃、高温试验(35±2)℃;同时监测在低温(-5~-20℃)冻存条件下药品到有效期终点时的质量稳定性数据及复溶后的质量稳定性数据;采用趋势分析和批内批间变异系数分析药品的稳定性。结果该药品在3年有效期内(2~8℃)保存,各项质量指标的检测结果均符合要求,批内、批间一致性亦符合要求;在室温保存条件(25±2)℃,6个月和高温(35±2)℃,15 d情况下,药品的各项质量指标同样符合《中国药典》的标准。药品在低温冻存(-5~-20℃)条件下至有效期终点,其关键质量指标均符合标准。药品复溶后在2~8℃保存6 d,其效价持续稳定,无菌检查合格。结论注射用A型肉毒毒素在≤8℃条件下保存的有效期为3年,在室温连续保存期限为6个月,高温条件连续保存时限为15 d。药品复溶后在2~8℃无菌条件可保存6 d。     

H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗稳定性研究

目的评价H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的稳定性。方法采用国内自主构建的重组H7N9禽流感病毒疫苗株毒种制备单价疫苗原液,制备含MF59佐剂的成品疫苗。按照企业注册质量标准进行检定,分别放置于(37±2)℃、(25±2)℃和(5±3)℃环境下,观察不同时间疫苗的稳定性。结果经检定,成品疫苗的外观、装量、无菌检查、异常毒性检测、细菌内毒素含量、渗透压质量摩尔浓度及其他检定项目均符合企业注册质量标准。H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗在(37±2)℃保存3 d、在(25±2)℃保存3个月、在(5±3)℃保存30个月,疫苗各项指标均符合企业注册质量标准。结论 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗具有良好的稳定性。     

荧光定量PCR检测重组新蛭素中毕赤酵母基因组DNA的残留量

目的:建立real-time PCR定量检测毕赤酵母基因组DNA残留量的方法,提高重组新蛭素的产品安全性。方法:选择拷贝数高且分布广泛的毕赤酵母5S rRNA基因为靶标基因设计扩增引物,提取酵母基因组DNA,稀释后作为扩增模板。以罗氏荧光定量PCR_LightCycler480平台为基础,建立基于SYBR GreenⅠ荧光染料的real-timePCR的检测方法,并考察用该方法检测重组新蛭素中毕赤酵母基因组残留量的灵敏度、精密度和回收率。结果:该法检测宿主DNA残留量灵敏度高,DNA浓度为0.1~1000 pg/μL范围内呈现良好的线性关系,其标准曲线的误差值小于0.2;用该法对5批注射用重组新蛭素(酵母)产品中宿主基因组DNA残留量进行了测定,结果分别为0.03、2.3、0.2、0.6、0.2 pg/mg。结论:该方法具有操作简便、灵敏度高等优点,可用于重组产品中酵母基因组残留DNA的定量测定。     

甲型H1N1流感病毒血凝素HA1在糖基工程毕赤酵母中的表达

目的:建立用糖基工程酵母制备流感血凝素的方法 ,研究其免疫原性,为酵母表达流感疫苗提供基础。方法:通过PCR的方法扩增编码H1N1流感病毒血凝素HA1(1～330 aa)的基因片段,将HA1基因克隆到表达载体pPIC9质粒上,电转化到糖基工程酵母中,甲醇诱导表达并用镍亲和层析柱纯化重组蛋白,N-糖苷酶F(PNGF)酶切分析N-糖链,Western印迹验证纯化蛋白,免疫小鼠并测定HA1诱导抗体的滴度。结果:获得HA1基因的酵母重组表达菌株,SDS-PAGE分析可见野生型GS115表达的重组HA1相对分子质量约为100×103,而糖基工程酵母GJK01表达的HA1约为60×103,PNGF酶切后相对分子质量均降至45×103左右;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,野生型和糖基工程酵母表达的HA1分子大小不同是由于不同的N-糖基化修饰引起的。重组HA1免疫小鼠可产生抗HA1抗体,随着抗原剂量的增加,其产生的抗体滴度相应增加;3次免疫后,4μg HA1诱导小鼠产生的抗体滴度最高。结论:利用糖基工程酵母表达制备了低糖化的流感病毒血凝素HA1,该重组蛋白可以诱导小鼠产生HA1抗体,且产生的抗体滴度具有HA1剂量依赖性。     

重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法的验证

目的 对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析方法亲水相互作用液相色谱法进行方法学验证,并根据多批次产品的检测结果制定质量标准。方法 参考《中华人民共和国药典》2020版(三部)通则9101中相关要求及重组人源化抗CD52单克隆抗体的制造与检定规程,对单克隆抗体N-糖糖型的分析方法进行方法学验证,验证项目包括专属性、线性、准确度、精密度、范围和耐用性。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体产品(≥15批)的N-糖糖型的检测结果进行分析,计算非岩藻糖及半乳糖的相对含量,确定质量标准。结果 空白对照、阴性对照对重组人源化抗CD52单克隆抗体N-糖糖型的分析无干扰;在60～300μg的抗体含量范围内线性良好,r²≥0.99;高、中、低3种抗体含量的回收率均在96%～106%;仪器进样重复性、样品制备重复性及中间精密度均良好,峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%;耐用性考察时各条件下的峰面积百分比及保留时间的RSD均≤5%。对多批次重组人源化抗CD52单克隆抗体的检定结果进行统计分析,确定N-糖糖型分析的质量标准为非岩藻糖相对含量4%～20%,半乳糖相对含量≥2...     

重组小鼠血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和纯化

目的：建立毕赤酵母重组小鼠血管内皮生长因子（mVEGF）的制备方法,为研究mVEGF的生物活性、抗原性等提供基础。方法：通过全基因合成方法获得编码mVEGF的基因片段,将其克隆至表达载体pPICZaA上,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中,用甲醇诱导表达目的蛋白,表达上清经硫酸铵沉淀、SephadexG25柱脱盐、阳离子交换层析三步纯化获得目的蛋白;用还原型和非还原型SDS-PAGE检测目的蛋白的聚体状态,用Westelqq印迹验证纯化蛋白;通过PNGaseF酶切分析目的蛋白的N-糖基化修饰;通过人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖实验检测目的蛋白的生物活性。结果：获得mVEGF的重组毕赤酵母表达菌株,SDS-PAGE分析可见GSll5表达的重组mVEGF在还原状态下表观相对分子质量约为20×10^3,在非还原状态下约为40×10^3;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,能被兔抗mVEGF抗体特异性结合,PNGase F酶切后相对分子质量降至18×10^3左右,证明目的蛋白发生了Ⅳ-糖基化修饰;细胞测活实验表明,mVEGF具有刺激HUVEC增殖的生物活性。结论：利用毕赤酵母菌制备了具有生物活性的重组mVEGF。     

H-Ras结构域的原核表达及纯化

目的:克隆人H-Ras部分片段基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化。方法:采用PCR技术从质粒Myc-H-Ras中扩增H-Ras(1-165)和H-Ras(165-189)结构域片段,将其克隆到p GEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达与纯化产物。结果:从Myc-H-Ras质粒中分别扩增获得约500和100 bp的DNA片段,并克隆至p GEX-KG载体,经测序与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量分别为46×103和29×103的目的蛋白,经纯化后获得了纯度较高的重组蛋白GST-H-Ras(1-165)和GST-H-Ras(165-189)。结论:获得了重组蛋白GST-H-Ras(1-165)、GST-H-Ras(165-189),为后续深入研究H-Ras影响肿瘤细胞生长的机制奠定了实验基础。     

抗胱抑素C鸡卵黄IgY抗体的制备及鉴定

目的:制备高效价、高特异性的抗人胱抑素 C 鸡卵黄 IgY 抗体,并对其基本特性进行分析和鉴定.方法:以人胱抑素 C 为抗免疫产蛋的罗曼鸡,采用水稀释-盐析法提取及纯化 IgY 抗体,采用蛋白质定量、SDS-PAGE、West?ern 印迹和 ELISA 法对 IgY 抗体进行分析和鉴定.结果:免疫后14 d 即可从鸡冠血中检测出抗胱抑素 C 的特异性抗体,抗体效价在28 d 达最高峰(1∶32000),并可维持2个月以上;收集高效价时的免疫鸡蛋,制备鸡卵黄抗体 IgY;还性 SDS-PAGE 显示抗体 IgY 为相对分子质量分别为65×103和21×103的2条带,抗体纯度可达92%,得率为每个鸡蛋36.5 mg,抗体检出敏感度为15.63 ng/mL;Western 印迹证明该抗体具有高度特异性.结论:制备了抗胱抑素 C 的高效价、高特异性 IgY 抗体.     

禽多杀性巴氏杆菌C48-3株成熟黏附蛋白的表达及其免疫原性检测

目的：在大肠杆菌原核表达系统中高效表达禽多杀性巴氏杆菌成熟黏附蛋白Cpm39,并检测其免疫原性。方法：通过BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组载体pMD18-cpm39获得cpm39基因片段,将该基因片段克隆至表达载体pMAL-p2X上,构建表达质粒pMAL-p2X-cpm39,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下表达融合蛋白,用禽多杀性巴氏杆菌C48-3株Cp39天然粘附蛋白的免疫血清经Western印迹检测其免疫原性。结果：SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白相对分子质量为78×103,与预期结果相符,而Western印迹结果表明诱导表达的融合蛋白MBP-Cpm39能与Cp39天然黏附蛋白抗体发生特异性反应。结论：构建了表达质粒pMAL-p2X-cpm39,获得了具有免疫原性的重组融合蛋白,为进一步研究禽多杀性巴氏杆菌成熟黏附蛋白的免疫保护功能奠定了基础。     

重组鼠疫耶尔森菌LcrV抗原原液性质研究

目的进行重组鼠疫耶尔森菌LcrV抗原原液二聚体含量及性质研究,确定LcrV原液的相关质控标准。方法在不同缓冲体系(0.85%NaCl(NS)、20 mmol/L PBS),不同蛋白浓度(2.0、1.5、1.0、0.5、0.1 mg/mL)及不同保存温度(4℃、-20℃、-70℃)条件下保存LcrV抗原,采用SDS-PAGE和HPSEC方法定期检测LcrV二聚体含量及纯度。将连续三批检定合格的LcrV抗原原液进行质谱相对分子质量测定、等电点测定、N末端氨基酸序列测定、圆二色(CD)谱、HPLC肽谱及氨基酸组成分析,研究LcrV抗原的相关性质。结果随着保存时间的延长LcrV抗原二聚体含量增加,低温保存时二聚体不易大量形成。在-20℃和-70℃条件下,NS保存的LcrV抗原比PBS体系保存稳定,而在4℃条件下NS保存的LcrV抗原容易降解。LcrV抗原高浓度保存容易发生聚合。LcrV抗原在低质量浓度(0.1 mg/mL)保存时免疫学活性明显下降。质谱检测到LcrV单体和二聚体共同存在,且与理论相对分子质量一致。LcrV原液检测等电点范围为4.6～6.3。N末端测序、CD谱、HPLC肽谱图及氨基酸组成分析与理论结果一致。结论 LcrV抗原原液保存条件确定为:NS体系,蛋白质量浓度1.0～2.0 mg/mL,-20℃以下冻存。制备的LcrV抗原各项检测结果与理论结果一致,抗原性质稳定。     

结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化

目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。     

人自噬相关蛋白ATG7的原核表达及纯化鉴定

目的:原核表达并纯化自噬相关蛋白ATG7,初步鉴定其生物学活性。方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人ATG7基因的编码序列,插入载体p ET-28a(+)得到重组质粒,经Bam HⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Rossate菌株进行小量诱导,纯化融合蛋白His-ATG7,通过Western印迹和SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果。结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约2031 bp的目的片段,插入载体p ET-28a(+)后构建出His-ATG7重组质粒,并经酶切鉴定及测序证实无误;转化大肠杆菌Rossate并进行小量诱导,纯化后SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为78×103的融合蛋白。结论:纯化得到原核系统表达的His-ATG7融合蛋白,为后续研究ATG7在自噬中的作用机制奠定了实验基础。     

伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液稳定性研究

目的评价伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液的稳定性,为该疫苗原液的制备、储存提供有力的数据支持。方法选取3批伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液分别放置于(37±2)℃、(25±2)℃和2~8℃温度下,根据稳定性研究方案定期取样,对其主要评价指标(多糖含量、结合物含量、相对分子质量、鉴别试验)进行检测,评估疫苗原液的稳定性。结果伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液于2~8℃放置22个月,(25±2)℃放置52 w,(37±2)℃放置24 w时,各项主要评价指标均符合其质量标准的要求。结论伤寒Vi多糖蛋白结合疫苗原液稳定性良好,在2~8℃可稳定存放22个月。