重组低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵工艺研究及其纯化与鉴定

目的:通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进,建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白(EH)的中试发酵工艺,为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法:首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线,然后根据生长曲线,将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后,直接接种到500 L的发酵罐中放大培养,通过发酵液的D600nm值、溶氧值(DO2)及菌体湿重动态监测细菌的生长状态,并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白;表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白;用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度;用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量;用Western印迹验证目的蛋白;用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果:发酵结束时,上清中蛋白含量达1.41 g/L,经后期分离纯化,得到约21 g EH蛋白,SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13.2×103±0.2×103,质谱分析相对分子质量约为7.3×103±0.73×103;Western印迹表明检测条带为目的蛋白,能被抗水蛭素抗体特异性结合;非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95%;凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512~1024 ATU/mg。结论:建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。     

甲型H1N1流感病毒血凝素HA1在糖基工程毕赤酵母中的表达

目的:建立用糖基工程酵母制备流感血凝素的方法 ,研究其免疫原性,为酵母表达流感疫苗提供基础。方法:通过PCR的方法扩增编码H1N1流感病毒血凝素HA1(1～330 aa)的基因片段,将HA1基因克隆到表达载体pPIC9质粒上,电转化到糖基工程酵母中,甲醇诱导表达并用镍亲和层析柱纯化重组蛋白,N-糖苷酶F(PNGF)酶切分析N-糖链,Western印迹验证纯化蛋白,免疫小鼠并测定HA1诱导抗体的滴度。结果:获得HA1基因的酵母重组表达菌株,SDS-PAGE分析可见野生型GS115表达的重组HA1相对分子质量约为100×103,而糖基工程酵母GJK01表达的HA1约为60×103,PNGF酶切后相对分子质量均降至45×103左右;经Western印迹检测,这些条带均为目的蛋白条带,野生型和糖基工程酵母表达的HA1分子大小不同是由于不同的N-糖基化修饰引起的。重组HA1免疫小鼠可产生抗HA1抗体,随着抗原剂量的增加,其产生的抗体滴度相应增加;3次免疫后,4μg HA1诱导小鼠产生的抗体滴度最高。结论:利用糖基工程酵母表达制备了低糖化的流感病毒血凝素HA1,该重组蛋白可以诱导小鼠产生HA1抗体,且产生的抗体滴度具有HA1剂量依赖性。     

血小板衍生生长因子BB亚型在毕赤酵母中的表达及纯化

目的:用毕赤酵母表达系统表达重组人血小板衍生生长因子BB亚型(PDGF-BB)。方法:采用PT-PCR从人早幼粒白血病细胞系HL-60细胞中获得目的基因,克隆到表达载体p MEX9K中,质粒线性化后转化酵母表达菌株GS115,筛选后的酵母表达菌株经BMGY/BMMY培养基体系诱导表达后,通过疏水作用、离子交换、凝胶过滤纯化获得目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western印迹、N端氨基酸序列和MTT增殖活性测定等方法检测目的蛋白性质及生物活性。结果:重组人PDGF-BB为分泌表达,表达量大于100 mg/L;经三步纯化,获得纯度高于95%且具有较高活性(5.0×105IU/mg)的目标蛋白。结论:利用毕赤酵母表达系统表达重组人PDGF-BB,表达产量高,成本低,工艺简单,易于工业化放大,有良好的市场前景。     

不同分泌信号对豹蛙酶在巴斯德毕赤酵母中分泌效率的影响

目的：研究不同分泌信号对豹蛙酶（ONC）在巴斯德毕赤酵母中分泌效率的影响。方法：根据已知天然ONC的氨基酸序列,结合酵母偏爱密码子,设计并合成了ONC基因序列,通过融合PCR获得了不同分泌信号与ONC的融合基因,将其克隆至表达载体pPIC9k中,然后将线性化的重组表达载体电击转化GS115毕赤酵母感受态细胞,通过SDS-PAGE检测目的蛋白表达量。结果：糖基化ONC表观相对分子质量为（14～16）×103,且其糖基化不均匀,非糖基化蛋白肽链的相对分子质量约为12×103;采用不含EAEA结构的α交配因子作为分泌信号时ONC没有表达,利用含EAEA结构的α交配因子和α交配因子的pre肽作为分泌信号时均能够显著提高其表达量。结论：采用含EAEA结构的α交配因子和α交配因子的pre肽作为分泌信号均能够显著提高ONC在巴斯德毕赤酵母中的表达量。     

节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化

目的：构建节杆菌BT801乙内酰脲水解酶（HyuH）与GST融合表达载体,利用大肠杆菌表达GST-HyuH融合蛋白并纯化。方法：将节杆菌HyuH基因插入载体pGEX-KG构建重组表达质粒pGEX-KG-HyuH;SDS-PAGE检查GST-HyuH的表达;利用薄层层析检查融合蛋白的HyuH活性;最后利用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂纯化融合蛋白GST-HyuH。结果：SDS-PAGE表明重组菌在相对分子质量77×103处有特异的蛋白表达条带,且重组菌可以水解5-苯基乙内酰脲,纯化得到了有HyuH活性的纯度较高的GST-HyuH融合蛋白。结论：得到了有HyuH活性的GST-HyuH,为进一步研究HyuH的修饰奠定了基础。     

人vasorin蛋白的基因克隆、表达及纯化简

目的：克隆、表达人vasorin（VASN）蛋白。方法：利用PCR方法从HepG2细胞的cDNA中扩增获得目的基因,并插入带有6xHis标签的原核高效可溶性表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pET28a-VASN,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后目的基因获得表达,对融合目的蛋白进行Ni^2＋金属螯合柱纯化。结果：内切酶鉴定及基因序列测定证实重组表达质粒构建成功;对目的蛋白进行了原核表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为61x10^3的特异表达条带;Western印迹证实目的蛋白为VASN,且主要以包涵体形式存在;对经尿素变性的表达产物进行了亲和层析纯化,有利于以后的变性、复性过程。结论：获得了人VASN融合蛋白,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。     

重组斑马鱼 p8蛋白的原核表达及纯化

目的：在大肠杆菌中重组表达斑马鱼p8蛋白并纯化。方法：PCR扩增斑马鱼p8蛋白基因编码区,连接到带有6×His标签的原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-p8并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG诱导表达;优化表达条件后用Ni^2＋柱纯化重组蛋白。结果：构建了pET-28a-p8重组质粒;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的12．8×10^3。结论：获得了斑马鱼p8融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

重组hIL-10质粒构建及其在毕赤酵母SMD1168中的表达和纯化

构建重组hIL-10真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达,为进一步研究hIL-10生物学功能及临床应用奠定基础。PCR扩增目的基因hIL-10cDNA,经EcoRI/XbaI双酶切后,将其亚克隆至同样双酶切的载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-hIL-10;电转化法,将其转入毕赤酵母SMD1168,甲醇诱导Mut+型转化子基因表达;对目的蛋白进行检测及纯化。扩增出了目的基因hIL-10cDNA,重组质粒pPICZaA-hIL-10经酶切鉴定和序列测定正确;表达产物经SDS-PAGE分析在42.0kD处可见较浓染条带,Westernblotting分析可见特异条带;ELISA检测72h上清液中目的蛋白浓度可达1.973mg/L;纯化后目的蛋白纯度达67.0%。实现了重组hIL-10在毕赤酵母SMD1168中的成功表达和初步纯化。     

人源抗狂犬病毒糖蛋白稳定型抗体精氨酸密码子突变株的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的：对人源抗狂犬病毒糖蛋白（GPRV）单链二硫键稳定抗体（ScdsFv）进行精氨酸密码子修饰,实现其在酵母中的分泌表达,并检测其生物学活性。方法：参照巴斯德毕赤酵母偏好密码子,对抗GPRV ScdsFv原核表达基因进行密码子修饰,并通过点基因融合技术构建ScdsFv重组酵母表达基因,连接pPIC9K构建重组表达质粒pPIC9K-ScdsFv,电转化毕赤酵母GS115,经筛选后进行甲醇诱导表达。结果：SDS-PAGE及Western blot检测到重组表达质粒在30℃经甲醇诱导表达的蛋白相对分子质量为30000;荧光抗体试验验证ScdsFv能靶向结合GPRV;MTT试验说明ScdsFv能中和狂犬病毒,具有一定的细胞保护作用。结论：重组ScdsFv在酵母系统中可以有效表达。具有较好的生物学活性。     

注射用重组新蛭素的质量控制研究

目的:建立注射用重组新蛭素原液、成品的质量控制方法及内控质量标准。方法:利用纤维蛋白凝块法测定注射用重组新蛭素的生物学活性,非还原SDS-PAGE和RP-HPLC测定纯度,SDS-PAGE和质谱法分析相对分子质量,免疫印迹验证目的蛋白,其余检测项目按《中华人民共和国药典》(2010年版三部)规定进行。结果:用建立的方法对注射用重组新蛭素3批原液和成品进行了检定,原液抗凝比活性均为512 ATU/mg,非还原型SDS-PAGE和HPLC检测3批原液的纯度结果均大于95%;质谱法分析3批原液相对分子质量符合7.3×103±0.7×103,SDS-PAGE分析3批原液相对分子质量符合13.2×103±1.3×103;免疫印迹表明检测条带为目的蛋白,能被抗水蛭素抗体特异性结合;其余各项指标均符合内控质量标准及《中华人民共和国药典》(2010年版三部)的要求。结论:建立的质量控制方法和内控质量标准可以用于注射用重组新蛭素的检定和质量控制。     

重组人kallistatin蛋白在毕赤酵母中的高效表达及生物活性分析

为了研究kallistatin(Kal)的生物活性,本实验构建了可分泌表达Kal的毕赤酵母菌株。首先通过PCR方法从pAAV-Kal中扩增出KalcDNA,并克隆至酵母表达载体pPIC9,得到甲醇酵母分泌型表达载体pPIC9-Kal,然后将载体线性化并电击转化毕赤酵母GS115(his4),通过MD平板筛选出阳性表达菌株。阳性表达菌株在BMMY培养基(pH7.0)中29℃培养,经2%甲醇诱导表达96h,摇瓶表达量可达14mg/L。表达上清经PhenylSuperose、Heparin SepharoseFF分离纯化,目的蛋白纯度达到98%,分子量为58kDa。生物活性实验显示,所得到的Kal蛋白具有较好的抗氧化活性,过氧化物酶活性达到(163±4)U/(mg·min),可有效降低H2O2对LX-2细胞的氧化损伤。另外,重组产生的Kal还能抑制HUVEC细胞的增殖。本研究首次成功地利用毕赤酵母表达系统分泌表达了有生物活性的Kal,为继续开展其抗肿瘤活性奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突糖蛋白S。方法:根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物,并在5'引物和3'引物中引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点,2.2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体,再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞,G418筛选鉴定阳性重组子,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测诱导后上清。结果:对pPIC9k-S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因;重组酵母菌诱导表达后,SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量约为82×103,且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论:利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒(河北分离株)纤突糖蛋白S。     

Secretory expression and purification of the recombinant duck interleukin-2 in Pichia pastoris

Interleukin-2 (IL-2) is a vital cytokine secreted by activated T lymphocytes, and plays an important role in the regulation of cellular functions and immunity of animals. In this study, the recombinant duck IL-2 (rduIL-2) was secretory expressed in Pichia pastoris (P. pastoris). The recombinant P. pastoris strain was cultured in shake flasks and then scaled up in a 5.0-l bioreactor. The result showed that the maximal fresh-cell-weight of 594.1 g/l and the maximal OD600 of 408 were achieved in the bioreactor. The rduIL-2 was purified by two steps of purification procedures, and approximately 311 mg of rduIL-2/L fermentation supernatant was obtained. SDS-PAGE showed that the purified rduIL-2 constituted a homogeneous band of ~16 kDa or ~14 kDa corresponding to the glycosylated or non-glycosylated duIL-2 protein in size, respectively. The bioactivity of rduIL-2 was determined by lymphocyte proliferation assay. The result indicated that the rduIL-2 greatly promoted the proliferation of ConA-stimulated lymphocytes in vitro. The P. pastoris expression system described here could provide promising, inexpensive, and large-scale production of the rduIL-2, which lays the foundation for development of novel immunoadjuvants to enhance both the immunity of ducks against various infectious pathogens and vaccine efficacy.     

猪白细胞介素-6在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中的分泌表达

白细胞介素6 (Interleukin_6 ,IL_6 )是一种具有多种生物学效应的细胞因子,在疾病诊断与疫苗佐剂领域有广阔的应用前景。在本试验中,猪白细胞介素_6 (pIL_6 )的cDNA序列被克隆入甲醇酵母(Pichiapastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入P .pastorisGS115菌株。其重组菌株GS115 pPIC9K_IL6经1%甲醇诱导后,能分泌表达分子量约为2 4 5KD的重组蛋白,Westernblot确证为pIL_6。该酵母表达产物无N端糖基化修饰。用依赖IL6生长的B9细胞株检测提纯后的pIL_6 ,其生物学活性可达8×10 4 IU mg。     

来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶XYNB的高效表达及性质的比较分析

高效表达高比活木聚糖酶是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低其生产成本的有效途径。将橄榄绿链霉菌(Streptomyces olivaceoviridis) A1的高比活木聚糖酶成熟蛋白编码基因xynB克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组酵母,在重组酵母中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达,且表达产物具有生物学活性。在3L发酵罐中蛋白表达量约14mg/mL, 酶活性(效价)为1200IU/mL。SDSPAGE分析表明,表达的木聚糖酶XYNBa为糖基化蛋白, 分子量为31kD, 经脱糖基化处理得到21kD 的XYNBb, 与橄榄绿链霉菌A1所产原酶XYNB大小一致。通过对XYNB、XYNBa及XYNBb酶学性质的比较发现：三者在比活性、Vmax及热稳定性方面有较大差异。该酶对不同木聚糖的酶解产物的糖份分析表明：酶解产物的主要成分为木二糖、木三糖和木四糖,占总糖含量的95%以上。     

凡纳滨对虾溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达和活性检测

原核重组表达的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溶菌酶蛋白主要以包涵体形式存在, 经变性和复性处理后活性仍较差。研究将凡纳滨对虾溶菌酶基因(Lvlyz基因)克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中, 电击转化毕赤酵母GS115细胞, 经组氨酸营养缺陷培养基筛选和PCR检测获得转化子。对其进行连续甲醇诱导表达, 利用SDS-PAGE和C端携带的6×His标签,对发酵液上清进行Western blot检测, 结果表明19.3 kD左右的条带即是重组表达的溶菌酶蛋白。用溶壁微球菌平板抑菌法鉴定表达产物具有较强的抑菌能力。研究首次利用毕赤酵母真核表达系统实现对虾溶菌酶基因的可溶性表达, 并且表达产物的活性良好。