人源双歧杆菌的分离纯化及鉴定

利用改良的乳酸细菌（MRS）培养基从健康人群的粪便中进行双歧杆菌的分离筛选。结果表明：在添加有5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的MRS培养基上双歧杆菌的菌落呈典型的乳白色并带有蓝色,其他菌株的菌落呈白色或深蓝色。实验共分离出10株疑似菌株,经生理生化试验和Biolog自动微生物分析系统鉴定,结果发现其中4株为双歧杆菌,这4株菌中有3株为两歧双歧杆菌,1株为长双歧杆菌。和传统MBS培养基相比较,改良MRS培养基能显著提高筛选效率。     

适用于分离人肠道中双歧杆菌的选择性培养基

【目的】比较并评价5种双歧杆菌选择性培养基对人源双歧杆菌的分离效果,试图筛选出一种适用于人肠道中双歧杆菌分离培养的选择性培养基。【方法】采集6份健康人粪便样品稀释涂布于5种选择性培养基上,厌氧培养后计数菌落并挑选单菌落进行鉴定。同时提取样品中细菌宏基因组DNA,应用变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gel Gradient Electrophoresis,DGGE)和荧光定量PCR技术(Quantitative Polymerase Chain Reaction,q-PCR)揭示样品中双歧杆菌种类和数量,并以此为依据,客观评价上述5种选择性培养基的分离效果。【结果】BSM培养基和BLM培养基上双歧杆菌的计数结果与q-PCR的定量结果最为接近,并显著高于其它3种培养基。BLM培养基上分离到双歧杆菌的种类与DGGE图谱多样性分析的结果最为接近。【结论】BLM培养基是一种适用于人肠道中双歧杆菌分离培养的选择性培养基。     

一株双歧杆菌质粒聚合酶基因的PCR扩增和鉴定

目的PCR扩增人双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因。方法用改良型MRS双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离长双歧杆菌,PCR扩增长双歧杆菌质粒聚合酶(Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP)基因,对BPP基因检测阳性的PCR产物通过序列分析,进行鉴定。结果人长双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因PCR扩增后,经1.0%琼脂糖凝胶电泳,测得BPP基因的相对分子质量约为1.9 kb。通过BLAST序列比对分析与GenBank中相应基因同源性为96%。结论成功克隆了1株双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因,为构建与双歧杆菌宿主质粒相适应的载体奠定了基础。     

母乳和新生儿粪便细菌与母乳性黄疸的相关性分析

目的探讨母乳和新生儿粪便细菌与母乳性黄疸(BMJ)的相关性。方法以BMJ患儿为研究对象,并与健康新生儿对照。RT-PCR法检测母乳和新生儿粪便中细菌含量,比较BMJ组和对照组细菌含量的差别,分析血总胆红素与细菌含量的相关性。结果 (1)BMJ组母乳和新生儿粪便中青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌浓度显著低于对照组,差异均有统计学意义(均P0.01);(2)母乳两歧双歧杆菌与血清TSB显著负相关(r=-534,P=0.000);新生儿粪便青春双歧杆菌(r=-0.675,P=0.000)、两歧双歧杆菌(r=-0.598,P=0.000)和长双歧杆菌(r=-0.472,P=0.000)与血清TSB显著负相关。结论母乳中双歧杆菌含量下降可能与新生儿BMJ相关。     

双歧杆菌质粒聚合酶基因对质粒载体稳定性的影响

目的探讨双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因（Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP）对人工构建的大肠埃希菌～双歧杆菌穿梭质粒载体（shuttle vector）在长双歧杆菌中稳定性的影响。方法首先电转化质粒pBADs—A和pBADs-BPP至长双歧杆菌,培养鉴定后,接种含质粒pBADs—A和pBADs-BPP的双歧杆菌于AMP^-和AMP^＋的MRS培养液中。厌氧培养后,将样品涂布于AMP^＋的MRS固体培养板上计数菌落数。结果相同条件下质粒pBADs·BPP组菌落数高于质粒pBADs—A组（P〈0．05）。结论BPP可以增加质粒载体的稳定性。     

一株携带质粒的人两歧双歧杆菌的分离与鉴定

目的:分离携带天然质粒的人双歧杆菌.方法:用自制的改良型Blb双歧杆菌选择培养基,从人新鲜粪便分离双歧杆菌,对初步质粒检测阳性的单菌落通过糖发酵试验、(G C)mol%测定和16S rDNA序列分析,进行菌株鉴定.结果:筛选到一株携带天然质粒的人双歧杆菌,编号B200304,在1.0%琼脂糖凝胶上,测得质粒的相对分子质量约为22 kb.通过对该菌株的形态学观察和糖发酵试验等生理生化特征研究,证明该菌株为两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum);HPLC法测得其(G C)mol%为55.6,16SrDNA序列分析进一步证实该菌株为两歧双歧杆菌.结论:分离得到一株携带天然质粒的人两歧双歧杆菌新菌株.     

一种改良大便双歧杆菌计数方法

目的：研制一种大便双歧杆菌鉴别计数培养基。方法：利用大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶且活性较高的特性,在自制改良BS培养基中加入X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）作为底物,双歧杆菌水解底物释放出吲哚,产生颜色反应。结果：双歧杆菌菌落呈深蓝色。乳酸菌和其它细菌一般为白色或淡蓝色。结论：自制改良BS培养基上双歧杆菌与乳酸菌及其他细菌菌落有明显的鉴别性。适用于大便双歧杆菌鉴别计数。     

设计乳杆菌特异性引物并运用菌落PCR技术快速检出和鉴定四川泡菜中的乳杆菌

乳杆菌(Lactobacillus)是益生菌, 也是当前的研究热点之一。研究泡菜等样品中的乳杆菌需要快速的检出方法。根据已完成全基因组测序的14种乳杆菌的16S rDNA序列, 设计一对乳杆菌特异性引物。PCR检测结果表明该引物对乳杆菌和明串珠菌能扩增出800 bp的片段, 对表皮葡萄球菌、乳酸乳球菌和枯草芽胞杆菌却没有扩增条带, 具有一定的乳杆菌特异性。结合MRS乳杆菌半选择培养基和革兰氏染色, 运用菌落PCR技术, 可以快速高效地检出四川泡菜中的乳杆菌。再通过对PCR扩增片段测序, 可以将乳杆菌鉴定到种。从16份四川泡菜样品中检出了15株乳杆菌, 其中14株被鉴定为植物乳杆菌, 1株需进一步鉴定才能确定种。该方法可以检出乳杆菌新种。     

潜在多重耐药患者肠道内乳杆菌的分离与鉴定

目的从临床潜在多重耐药患者粪便中分离获得乳杆菌,完成种属鉴定并分析其临床意义。方法采集临床患者粪便,在MRS和含碳酸钙的LBS固体培养基上分离培养,挑取目的菌落反复分离获得纯化菌株,利用生化鉴定方法进行种属鉴定。结果 45份样本共得到7株乳杆菌,其中植物乳杆菌5株、鼠李糖乳杆菌2株。结论研究发现,分离到的植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌可能具有更强的耐受性与生物学活性。分离获得的植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌有待日后对其开展特性、耐受性及安全性等研究,以便对分离的菌株有更深入的认识。     

发酵乳中动物双歧杆菌乳亚种分离及鉴定

采用改良MRS培养基从蒙牛冠益乳酸奶中选择性分离得到2种乳酸菌, 表型特征检测初步确定目标菌株BB-12, 该菌株符合双歧杆菌属特征描述。通过Biolog微生物自动鉴定系统鉴定、16S rDNA序列分析、atpD基因序列分析, 多相鉴定表明: 菌株BB-12为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp. lactis)。系统发育学分析表明: atpD基因序列比16S rDNA序列在动物双歧杆菌亚种水平鉴定上有更好的分辨率。     

直投式酸奶发酵剂中双歧杆菌的分离

介绍一种简便可行的从直投式酸奶发酵荆中分离双歧杆菌的方法。发酵剂在液体培养基中活化后,在不同选择培养基上划线分离,根据菌落及菌体形态确定双歧杆菌。然后进行初步鉴定。     

婴幼儿粪便中双歧杆菌的分离及其菌株特性研究

为筛选具有潜在益生功能的双歧杆菌,本研究采用改良MRS培养基,从婴幼儿粪便中分离到5株菌株:AR499,AR667,AR668,AR669和AR610。通过16S r DNA测序分别鉴定为两歧双歧杆菌,短双歧杆菌,动物双歧杆菌,长双歧杆菌和假小链双歧杆菌。对其耐酸耐胆盐能力和黏附性能进行测试,结果表明,菌株AR499耐酸性较好,菌株AR610有较强的耐胆盐能力,菌株AR499的自动聚集能力和细胞表面疏水性都较高。实验表明,菌株AR499可作为一株耐受性和黏附性能较好的益生菌进一步深入研究,以期应用于优良双歧杆菌产品的开发。     

双歧杆菌四联活菌片中嗜酸乳杆菌的分离及生长动力学研究

目的以双歧杆菌四联活菌片为实验材料,利用酸化的MRS培养基筛选分离得到嗜酸乳杆菌,对其进行进一步的生长动力学研究,确定嗜酸乳杆菌的生长数学模型。方法通过浓度梯度稀释法利用改良MRS培养基对双歧杆菌四联活菌片中的嗜酸乳杆菌进行分离,利用分光光度仪和平板菌落计数两种不同的方法测定嗜酸乳杆菌在发酵过程中不同发酵时间的细胞浓度的动态变化,经软件处理后拟合出嗜酸乳杆菌细胞生长的Logistic数学模型。结果Logistic方程能很好地拟合嗜酸乳杆菌细胞生长的动态变化,并得到嗜酸乳杆菌在本实验条件下的数学模型,为进一步研究、利用嗜酸乳杆菌生长能力、产酸能力和产香能力等具有重要的理论指导意义。     

长双歧杆菌发酵培养基的优化

目的对长双歧杆菌液态发酵培养基进行优化。方法以长双歧杆菌（Bifidobacteriumlongum）为发酵菌株,以MRS培养基为基础培养基,以发酵液活菌数为指标,通过单因素添加实验考察发酵培养基的碳源和氮源的种类,并验证优化后培养基的效果。结果优化后培养基的最适碳源为葡萄糖,最适氮源为酪蛋白胨、牛肉蛋白胨、水解乳蛋白,发酵液活菌数达到2．09×10^9CFU／mL,比原MRS培养基（1．22×10^9CFU／mL）提高了71．30％。结论优化后培养基优于原MRS基础培养基,可应用于长双歧杆菌的液态发酵。     

长木蜂蜂粮中微生物丰度及抑菌活性菌株的筛选

长木蜂属于野生蜂类,后代的生存和繁衍完全依靠雌蜂所提供的蜂粮,蜂粮保鲜时间的长短对蜂群的繁衍具有关键性作用。本文采用营养琼脂培养基、改良"LB"培养基、MRS(4.5)、MRS(6.5)培养基分别对芍药的手采花粉、长木蜂蜂花粉和不同酿制时间的蜂粮样品中的微生物进行菌落计数、分析和分离鉴定。酿制初期的蜂粮样品在营养琼脂培养基生长的细菌菌落数占优势,随酿制时间的延长而迅速下降;7d、8d蜂粮样品在改良"LB"培养基上生长的细菌菌落数占优势;10d之后的蜂粮样品在MRS(6.5)培养基上微生物菌落数占优势;分离的68株菌株,其中细菌43株,酵母17株,放线菌8株。从蜂粮中分离的酵母菌和放线菌菌株均来自长木蜂雌蜂的体表。分离的68株菌株中有12株有较强抑菌活性,尤其是放线菌NF-34菌株对真菌和细菌均有抑菌活性。     

双歧杆菌属特异性测序引物筛选及优化

【背景】目前双歧杆菌的益生功能被普遍认可,越来越多的研究开始关注肠道中双歧杆菌的生物多样性。然而双歧杆菌是肠道中的低丰度物种,现有技术尚难以深入研究其多样性。【目的】基于双歧杆菌16SrRNA基因序列筛选一对适用于分析粪便样品中低丰度双歧杆菌属多样性的特异性引物。【方法】依据已有引物的相对位置及其与双歧杆菌属16S rRNA基因序列的匹配率,将引物重组优化得到扩增片段800 bp的双歧杆菌属特异性引物;通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行实验筛选和特异性验证;以细菌通用引物(27f/1492r)为参照,通过单分子实时(Single-molecule real-time,SMRT)测序技术对不同引物的3份粪便样品中细菌的DNA扩增子进行测序,在种水平上分析比较不同引物的优劣。【结果】对文献中已有的9对双歧杆菌特异性引物进行重组并优化,其中2对引物的理论特异性较好且扩增产物大于800 bp,它们分别为Bif164-f/Pbi R2和Pbi F1/Pbi R2。PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳实验发现,Bif164-f/Pbi R2的扩增条带明亮且无拖尾。此外,利用SMRT测序平台对引物27f/1492r和Bif164-f/Pbi R2的3份粪便样品中细菌的DNA扩增子进行测序并分析。27f/1492r扩增子的分析结果显示,3份样品依次分别含1、3、4个双歧杆菌种且双歧杆菌的平均相对含量为0.34%;而Bif164-f/Pbi R2扩增子的分析结果显示,3份样品依次分别含2、6和8个双歧杆菌种且双歧杆菌的平均相对含量为98.72%。上述结果表明,Bif164-f/Pbi R2可在种水平上特异地检出粪便中低丰度的双歧杆菌,进而实现样品中双歧杆菌的多样性分析。【结论】筛选出一对双歧杆菌特异性引物Bif164-f/PbiR2,可在种水平上分析粪便样品中低丰度双歧杆菌的生物多样性,同时也验证了理论结合实验进行引物筛选这种方法的可行性。     

母乳蛋白核心岩藻糖基化有利于新生儿肠道双歧杆菌增长

目的探究母乳蛋白核心岩藻糖基化水平的高低对新生儿肠道双歧杆菌丰富度的影响。方法采用凝集素印记(Lectin Blot, LB)检测不同母乳样品的母乳蛋白核心岩藻糖基化水平,根据蛋白核心岩藻糖基化水平的高低将母乳样品分为两组;采集两组母乳样品对应喂养的新生儿的粪便,通过16S RNA高通量测序的方法检测两组婴儿粪便中菌群的构成。结果母亲母乳蛋白核心岩藻糖基化水平高组相对于低组,其对应的新生儿肠道中双歧杆菌丰富度显著增高。结论高核心岩藻糖基化的母乳可以促进子代肠道中双歧杆菌的优势生长。     

一种双歧杆菌鉴别计数培养基的研制

目的 研制一种双歧杆菌鉴别计数培养基。方法 研制的改良ＭＲＳ培养基补充了双歧杆菌和乳酸菌需要的特殊营养成分,并依据大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶能特异性水解含半乳糖低聚糖的特征,加入５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖物质,作为底物,使双歧杆菌水解底物释放出吲哚,产生颜色反应。结果 双歧杆菌菌落呈蓝色,乳酸菌一般为白色或淡蓝色。结论 改良ＭＲＳ培养基上的双歧力和乳酸菌菌落有明显的鉴别性,适用于双歧杆菌和乳酸菌联合制剂的菌落计数。     

水貂粪便中双歧杆菌的分离与鉴定

目的运用TPY培养基,从健康水貂的粪便中分离培养、筛选出2个肠道菌株。方法细菌培养、菌落形态观察、染色镜检、分离纯化、生化试验和药敏试验。结果分离培养出的2株菌株为双歧杆菌,其中1株为长双歧杆菌,另1株为青春双歧杆菌;双歧杆菌对氯霉素极其敏感,对阿米卡星耐药。结论本实验为毛皮特种经济动物微生态制剂的研究工作奠定了基础。     

乳酸菌固体制剂计数方法研究

从培养基、稀释剂的角度对乳酸菌固体制剂样品进行计数方法比较。昂立1号○R优菌多颗粒样品中嗜酸乳杆菌在改良MC培养基上培养(72±3)h后菌落形态非常小,很难进行计数,在改良MC培养基中添加0.1%吐温80将会刺激嗜酸乳杆菌的生长,利于计数;采用MRS液体溶解复水10~15 m in、0.1%蛋白胨盐水稀释的计数结果明显高于直接采用生理盐水复水、稀释方法,两者差异有非常显著性。