分子生物学技术在肠道菌群研究中的进展

人的肠道中栖息着大量微生物,这些微生物与宿主形成一个相互依赖且相互制约的微生态系统。肠道菌群结构与遗传、饮食、疾病、环境等因素存在千丝万缕的联系,其地位与作用相当于一个后天获得的"器官",对人体的消化、营养吸收、能量供应、脂肪代谢、免疫调节、抗病等诸多方面有不可替代的作用,因此,研究人的肠道菌群具有十分重要的意义和作用。本综述着重论述荧光原位杂交(FISH)、基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳(Polymerase chain reaction denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技术、实时荧光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction)技术、基因芯片(Gene chip)技术及以焦磷酸测序平台为代表的第二代测序技术等多种分子生物学技术在肠道菌群研究方面的应用,并对未来肠道菌群方面的研究进行展望。     

哈尔滨城市和乡村青年居民肠道菌群多样性研究

【目的】分析居住于哈尔滨城市和乡村的青年居民肠道菌群多样性的异同。【方法】采用PCR和DGGE技术相结合的方法对生活于哈尔滨城市和乡村的青年志愿者肠道菌群多样性进行研究。基于DGGE指纹图谱,分别使用聚类和PCA分析对志愿者肠道微生物相似性进行分析,使用Shannon-Weine多样性指数(H′)、丰度(S)和均匀度(EH)对志愿者肠道微生物多样性进行分析,对图谱中具有代表性的共性和特异性条带进行胶回收和克隆测序以分析志愿者肠道微生物组成。基于PCR技术在种水平上对城乡志愿者肠道内乳杆菌属和双歧杆菌属多样性进行定性分析。【结果】相似性分析显示,城乡青年居民间肠道微生物群落结构存在分开趋势,相似性小于城市或乡村青年居民内部;多样性分析显示,城乡青年居民肠道微生物多样性差异不显著;测序结果表明,城乡居民肠道微生物组成在门水平上相同,但是在种属水平上存在差异。PCR定性分析显示Lactobacillus plantarum、L.casei和L.salivarius在哈尔滨城乡青年居民肠道内检出率接近100%,Bifidobacterium longum和B.breve的检测率约90%,在哈尔滨城乡青年居民肠道内普遍存在;乳杆菌属和双歧杆菌属各细菌种在城乡居民肠道中的检出频率差异不显著。【结论】哈尔滨城市和乡村青年居民肠道微生物多样性差异不显著。     

抗生素和高脂饮食对大鼠肠道乳杆菌多样性的影响

【目的】对正常、高脂、抗生素处理大鼠肠道内乳杆菌进行定性和定量分析,比较不同处理组大鼠肠道乳杆菌的多样性。【方法】应用纯培养和非培养技术(16S r RNA基因序列分析、变性梯度凝胶电泳、实时荧光定量PCR)对大鼠肠道乳杆菌进行分离鉴定和多样性分析。【结果】16S r RNA基因序列同源性分析结果显示,正常组大鼠肠道内分离出的乳杆菌包括约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、肠道乳杆菌(Lactobacillus intestinals)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)和阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis);但L.animalis在高脂处理组大鼠肠道内未分离到,L.intestinals和L.vaginalis在抗生素处理组大鼠中未分离到。DGGE结果显示3个组别大鼠肠道中乳杆菌构成差异明显,同一组内样品间相似性较高;相较于正常组和高脂组,抗生素组的丰度较差;且正常组大鼠肠道内乳杆菌的多样性高于高脂组和抗生素组。q-PCR结果显示正常组大鼠肠道乳杆菌的数量明显高于高脂组和抗生素组,高脂组的数量也明显高于抗生素组,且3个组别之间存在显著差异(P0.01)。【结论】高脂饮食及抗生素的使用会减少肠道内乳杆菌多样性。     

饲用微生态制剂替代抗生素的研究进展

饲用抗生素的过度使用衍生出药物残留和抗药性两大严峻的问题,因此减少甚至禁止抗生素的使用并寻找适宜的替代物已到了刻不容缓的地步。时至今日,绿色、安全且无残留的益生菌微生态制剂以其改善宿主肠道菌群平衡、促进消化吸收、增强免疫力等功效正在逐步跻身于促生长饲料添加剂的行列以替代抗生素的使用。本综述着重论述益生菌微生态制剂的作用机制和应用现状。同时论述包括合生元和微胶囊化开发技术及抗生素与益生菌微生态制剂的配伍使用,以期为今后促生长饲料添加剂的开发提供一定的理论基础。     

适用于分离人肠道中双歧杆菌的选择性培养基

【目的】比较并评价5种双歧杆菌选择性培养基对人源双歧杆菌的分离效果,试图筛选出一种适用于人肠道中双歧杆菌分离培养的选择性培养基。【方法】采集6份健康人粪便样品稀释涂布于5种选择性培养基上,厌氧培养后计数菌落并挑选单菌落进行鉴定。同时提取样品中细菌宏基因组DNA,应用变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gel Gradient Electrophoresis,DGGE)和荧光定量PCR技术(Quantitative Polymerase Chain Reaction,q-PCR)揭示样品中双歧杆菌种类和数量,并以此为依据,客观评价上述5种选择性培养基的分离效果。【结果】BSM培养基和BLM培养基上双歧杆菌的计数结果与q-PCR的定量结果最为接近,并显著高于其它3种培养基。BLM培养基上分离到双歧杆菌的种类与DGGE图谱多样性分析的结果最为接近。【结论】BLM培养基是一种适用于人肠道中双歧杆菌分离培养的选择性培养基。     

白族成年人肠道菌群多样性研究

【目的】通过研究云南白族成年人肠道菌群群落结构,探索肠道菌群结构与云南白族人健康长寿的相互关系。【方法】以43份采自云南省昆明市(Urban)和大理白族自治州洱源县农村(Rural)成年白族志愿者的粪便样品为研究对象,通过种属特异性聚合酶链式反应(定性PCR)和基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)对其中的优势菌群进行了分析,并测定样品中短链脂肪酸(SCFAs)含量。【结果】短链脂肪酸(SCFAs)含量测定结果显示,Rural和Urban志愿者的短链脂肪酸含量差异不显著;定性PCR结果显示Rural志愿者肠道内的乳杆菌属和双歧杆菌属的多样性明显区别于Urban志愿者;依据泳道轨迹光密度的不同对16S rRNA基因V3区PCR-DGGE图谱进行基于非加权平均距离聚类分析(Unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA),显示两组样品按照组别明显地聚为两簇,多样性指数分析也呈现Rural志愿者肠道菌群多样性大于Urban的趋势;进一步对Rural谱带回收克隆测序,并构建系统发育树图,结果显示样品中双歧杆菌属、肠杆菌属和肠球菌属具有较高的多样性,是Rural健康成年志愿者肠道中的优势菌群。【结论】综合上述分析,昆明城市志愿者和大理白族自治州洱源县农村志愿者肠道菌群群落结构呈现区分趋势,多样性差异不显著。该研究为后续探索宿主肠道菌群与健康长寿的相互关系提供了数据基础。