携带HLA-B2704基因转基因小鼠技术的建立

应用显微注射法制备携带HLA B2 70 4基因的转基因小鼠 .对 2 86只昆明小鼠激素注射进行超排卵 ,采集受精卵 ,将含HLA B2 70 4基因的基因组DNA片段 (简称HLA B2 70 4DNA)显微注射到受精卵原核内 ,把注射存活的两细胞期受精卵移入假孕鼠的输卵管内使其发育产生后代 .用PCR方法进行F0代仔鼠及F1代仔鼠的转基因整合的检测 .利用RT PCR检测阳性鼠中的HLA B2 70 4转基因的表达 .采集了 84 11个卵 ,可注射卵 6 6 0 9个 ,其中注射存活的两细胞期受精卵 4 2 77个 ,卵的注射存活率为 6 4 7%.将卵移入 15 3只假孕鼠 ,其中 2 6只怀孕产仔 ,存活 10 1只 .在 10只F0代仔鼠基因组中有HLA B2 70 4基因整合 ,整合率为 9 9%.转基因阳性鼠F0代之间以及与正常鼠之间进行交配 ,产生的F1代仔鼠 78只 ,其中 15只为阳性 .阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有HLA B2 70 4转基因mRNA的表达 .在HLA B2 70 4转基因阳性小鼠中 ,6只小鼠皮肤出现脱毛 ,1只小鼠的足部及足趾明显红肿 ,2只在脱毛同时明显畏光 ,1只出现腹泻 .结果表明 ,成功地建立了HLA B2 70 4的转基因小鼠技术 ,该小鼠类似强直性脊柱炎的小鼠模型 .     

人β_2m转基因小鼠的制备及鉴定(英文)

制备人 β2m转基因小鼠 ,研究HLA B2 70 4基因的表达 .应用显微注射将人 β2m基因注入C5 7BL 6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵 .出生动物及其后代经PCR筛选 ,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本进行进一步鉴定和测定整合拷贝数 ,利用RT PCR检测阳性鼠中人 β2m转基因的表达 .6只原代仔鼠及 7只它们的下一代鼠 (F1)带有人 β2m基因 .由微注射基因后移卵出生的 86只小鼠中 ,C5 7BL 6×昆明鼠杂交仔鼠 35只 ,其中 4只阳性 (11 4 % ) ,昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠 5 1只 ,其中 2只阳性 (3 9% ) ,含有人 β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠 2 0只 ,其中 7只阳性 .整合的转基因均为单拷贝 .Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合 .阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达 .在转基因动物制备中 ,C5 7BL 6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代 .与人HLA B2 70 4基因相比 ,人 β2m基因不易整合 ,其整合率与整合拷贝数均较低 .得到的人 β2m转基因小鼠能够将人 β2m基困传给下一代 ,并可与人HLA B2 70 4转基因鼠交配 ,研究它的致病性     

人β_2m转基因小鼠的制备及鉴定(英文)

 制备人 β2m转基因小鼠 ,研究HLA B2 70 4基因的表达 .应用显微注射将人 β2m基因注入C5 7BL 6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵 .出生动物及其后代经PCR筛选 ,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本进行进一步鉴定和测定整合拷贝数 ,利用RT PCR检测阳性鼠中人 β2m转基因的表达 .6只原代仔鼠及 7只它们的下一代鼠 (F1)带有人 β2m基因 .由微注射基因后移卵出生的 86只小鼠中 ,C5 7BL 6×昆明鼠杂交仔鼠 35只 ,其中 4只阳性 (11 4 % ) ,昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠 5 1只 ,其中 2只阳性 (3 9% ) ,含有人 β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠 2 0只 ,其中 7只阳性 .整合的转基因均为单拷贝 .Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合 .阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达 .在转基因动物制备中 ,C5 7BL 6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代 .与人HLA B2 70 4基因相比 ,人 β2m基因不易整合 ,其整合率与整合拷贝数均较低 .得到的人 β2m转基因小鼠能够将人 β2m基困传给下一代 ,并可与人HLA B2 70 4转基因鼠交配 ,研究它的致病性     

TIMP-1转基因小鼠纯合子的建立及建系

采用遗传学育种方法 ,使外源基因整合位点随机的基质金属蛋白酶抑制剂 1(TIMP 1)转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠而建立TIMP 1转基因小鼠品系 .通过受精卵原核显微注射方法 ,获得带有人TIMP 1基因的Founder小鼠 .将转基因小鼠与正常小鼠交配 ,得到子代小鼠 .通过PCR及Southern印迹等方法 ,检测TIMP 1DNA在转基因小鼠体内的整合情况 ,阳性率达5 0 %后 ,进行近亲交配 .提取小鼠组织总RNA ,Northern印迹分析阳性小鼠各组织外源性TIMP 1mRNA表达情况 ,以正常NIH小鼠做对照 .获得了 6代小鼠共 4 2 4只 ,其中PCR阳性鼠 2 72只 ,Southern阳性鼠 2 2 6只 ,纯合子转基因小鼠 12 8只 ;F4代后阳性率达到 95 %以上 .转基因小鼠TIMP 1基因表达情况在肾脏的丰度明显高于肝脏和脾脏 (P <0 0 1) ,而肝和脾之间并没有显著差异 (P>0 0 5 ) .外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传 ,并得到了整合有TIMP 1基因的纯合子转基因小鼠 ,且在阳性的转基因小鼠体内在肾脏中特异性表达 ,为以后开展TIMP 1的肾脏病理生理研究提供了有用的手段     

肝组织特异表达人核受体nr5a2转基因小鼠的构建

人乙肝病毒增强子ⅡB1结合因子（hB1F）系Ftz—F1（NR5A）亚家族的新成员。经基因重组法将人hb1 fcDNA置于小鼠白蛋白增慢子／启动子序列下游构建成肝特异重组载体,通过原核显微注射将该载体导入小鼠受精卵原核,经注射且状态良好的卯回输至假孕母鼠输卯管。产下仔鼠经PCR和Southern blotting鉴定,同时RT—PCR和Western blotting分析转基因的表达。阳性Founder鼠与正常C57鼠交配以建立转基因纯系小鼠,F1代以PCR法鉴定。结果共获得4只PCR鉴定转基因阳性Founder鼠,其中一只同时经Southern blotting鉴定为阳性。RT—PCR和Western blotting结果显示,外源基因在转基因小鼠的肝组织成功表达。遗传学分析表明,转基因已整合入小鼠基因组并可稳定溃传。     

成骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

构建了含有骨钙素基因启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pOC-Cre, 以显微注射的方法将4.6 kb的转基因片段OC-Cre导入小鼠受精卵。16只子代小鼠中经PCR和Southern杂交鉴定, 有2只小鼠携带外源基因, 整合率为12.5%。为了检测OC-Cre在转基因小鼠中表达的组织特异性, 将转基因首建者小鼠与基因组上携带有LoxP位点的条件性Smad4基因敲除小鼠交配, PCR结果显示, 仅在子代纯合型小鼠骨组织基因组中扩增出了Cre介导重组后的片段。将OC-Cre转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配, 利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测, 结果显示Cre重组酶在成骨细胞中特异性表达并介导ROSA基因座LoxP位点间的重组。所有这些结果说明：所建立的OC-Cre转基因小鼠在成骨细胞中特异性表达Cre重组酶, 并能在体内介导成骨细胞基因组上LoxP位点间的重组, 是一种理想的研制成骨细胞特异性基因敲除小鼠的工具小鼠。     

血管内皮生长因子 (VEGF1 83)转基因小鼠的建立(英文)

采用显微注射法 ,将一个由 1.3kb人感光细胞间维生素A类结合蛋白 (hIRBP)启动子区和人血管内皮生长因子 (hVEGF183)cDNA所构成的融合基因片段HIRV183导入 2 89枚ICR小鼠受精卵的雄性原核 .制备当代 (G0 )转基因小鼠 ,共得G0 代小鼠 17只 .经PCR和PCR Southern方法筛选得到 1只为hVEGF183转基因阳性小鼠 ,整合率为 5 9%,转基因总效率为 0 3%.将其与正常ICR小鼠交配 ,经PCR和dot blot杂交鉴定后代 (F1)小鼠阳性整合率为 4 5 9%.F1代兄妹之间进行交配 ,后代 (F2 )小鼠阳性整合率为 6 7 6 %.结果表明 ,外源基因hVEGF183整合在小鼠染色体的单一位点 ,为以后利用转基因动物的方法对VEGF这个新型异构体VEGF183进行深入研究打下了基础     

人Man2c1转基因小鼠外周血中性粒细胞和CD8+T细胞的调节

目的以转hMan2c1基因小鼠为模型,分析hMan2c1基因在转基因小鼠脾脏的蛋白表达和活性,研究hMan2c1基因对于机体免疫系统的影响。方法Western blot方法检测hMan2c1基因在脾脏的蛋白表达并检测小鼠脾脏α-甘露糖苷酶活性;血常规分析外周血中各种血细胞的比例;以BSA作为抗原观察机体的免疫应答;流式细胞技术观察外周血中CD4 、CD8 、B、NK细胞的数量。结果Western blot结果显示,与野生型小鼠比较,hMan2c1基因在转基因小鼠脾脏组织有明显的表达,α-甘露糖苷酶活性明显增高,中性粒细胞明显升高。BSA刺激后,转基因小鼠外周血免疫细胞中的CD8 T淋巴细胞明显高于野生型小鼠。结论hMan2c1基因在小鼠脾脏表达引起α-甘露糖苷酶活性显著升高,并进一步影响淋巴细胞的生成,增加中性粒细胞和CD8 T淋巴细胞对免疫原的应答。     

四环素调控SV40Tag转基因小鼠模型的建立

目的构建四环素调控的SV40T转基因小鼠模型。方法同时显微注射外源基因p205-rtTA-C3和pTRE-Tag至FVB小鼠原核,注射受精卵移植到同期发情的假孕受体出生个体,经PCR和Southern检测获得阳性转基因小鼠。结果经PCR结合Southern检测得到rtTA和Tag双阳性转基因小鼠一只,rtTA单阳性两只和Tag单阳性一只。结论通过饮水给与四环素的双阳性小鼠可在卵巢中检测到Tag mRNA的表达。     

人促红细胞生成素在转基因小鼠乳汁中表达

将山羊的β乳球蛋白启动子连接人促红细胞生成素基因,构建转基因表达载体。通过显微注射的方法转基因小鼠。经PCR斑点杂交和Southern杂交检测验证,获得4只转基因阳性小鼠,其中3只母鼠哺乳期收集乳汁,经EpoELISA检测为阳性。对4组转基因阳性小鼠的部分子代母鼠,经PCR和Southern杂交分析,又鉴定出6只获得遗传的阳性G1代母鼠以Dot-ELISA的方法检测,其中两只G1代母鼠乳汁中的Epo含量为0.5μg/mL。实验证实,867bp的β乳球蛋白启动子可以指导人促红细胞生成素在小鼠乳汁中表达。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

基于四环素调控系统的ApoE-rtTA/TRE-HCV-C双转基因小鼠的制备

目的为了丰富现有的四环素调控系统的小鼠资源库,同时也为更好地研究目的基因HCV-C的作用机制提供一个活体的动物模型,制备基于四环素调控系统原理的调控部分ApoE-rtTA的转基因小鼠,与反应部分TRE-HCV-C转基因小鼠,相互交配制作出双转基因小鼠。方法应用显微注射法将构建好的两种基因片段ApoE-rtTA及TRE-HCV-C分别注入超排的昆明母鼠的受精卵,再植入假母输卵管,出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性,将两者及阳性后代交配产生携带5只转基因鼠再经Western blot和RT-PCR在RNA和蛋白水平上进一步鉴定。结果产生了3只整合有ApoE-rtTA基因的首见鼠和125只阳性子代,以及产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首见鼠和16只阳性子代。PCR及Southern Blot证实上述阳性鼠确有转基因整合。将两者交配产生携带5只双转基因鼠。结论成功制备了携带有ApoE-rtTA及TRE-HCV-C转基因小鼠,建立了分别携带有这两种基因的鼠群,以及同时携带有两种基因的双转基因小鼠,为四环素调控系统提供了一个良好的通用型的调控动物模型,同时也可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用,也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

HLA-Ⅱ类基因DRα及DRB1 *0401转基因小鼠模型的遗传与繁殖

采用类系祖建系的方法 ,对HLA -Ⅱ类基因DRα 和DRB1 　 0 4 0 1转基因小鼠模型进行了繁育。通过PCR和Southernblot分子杂交的方法 ,检测小鼠尾组织的DNA样品 ,以确定DR基因的整合和复制情况。结果表明 ,HLA -Ⅱ类基因DR已稳定地遗传至第五代(F5) ;共产仔 32 6只 ,PCR检测出阳性小鼠 95只 ,阳性率为 2 9.1 %。PCR—Southern印迹杂交检测 ,发现 68只仔鼠整合有DR基因 ,总有效率为 2 0 9%。经Nothern杂交和RT -PCR检测HLA -DR基因在脾脏和肾脏中均有表达。     

小鼠β-酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺的表达

为验证克隆的小鼠β－酪蛋白基因序列调控外源基因表达的能力,将人人t-PA突变体基因的信号肽－前肽编码序列用小鼠β－酪蛋白的信号肽编码序列替换,人t-PA突变体成熟肽cDNA融合到小鼠β－酪蛋白基因的第2外显子中,从而构建成旨在应用小鼠β－酪蛋白基因序列调控人t-PA突变体基因在小鼠乳腺中表达的载体。融合基因经显微注射到小鼠的受精卵中,285枚注射的受精卵移植到13只受体小鼠,经PCR和Southern杂交鉴定,42只出生小鼠中有12只为转基因阳性鼠。7只转基因阳性鼠乳汁中表达人t-PA突变体,最高表达水平为3．6593μg/ml,证明小鼠β－酪蛋白基因序列能够调控人t-PA突变体基因在转基因小鼠的乳汁中表达出具有生物活性的人t-PA突变体,为进一步制备了人t-PA突变体基因敲入小鼠模型提供了理论和实验依据。     

HLA-Ⅱ类基因DRα及DRB_1~*0401~1转基因小鼠的制备

利用受精卵原核的显微注射技术 ,将人类HLA Ⅱ类DRα及DRB1 0 4 0 1两种基因 ,显微注射至C5 7BL 6×DBA 1杂交小鼠受精卵中 ;并移植至假孕受体鼠的输卵管内。实验先后有 8只鼠妊娠 ,稳定遗传五代 ,经PCR检测 95只HLA DRα、DRB1 0 4 0 1阳性。α 32P dCTP斑点杂交与Southern印迹杂交鉴定出 6 8只整合含有DRα及DRB1 0 4 0 1混合型的转基因小鼠 ,有效率为 2 0 .9%。经Northern杂交[1] 和RT PCR检测 ,其HLA DRα、DRB1 0 4 0 1基因在脾脏和肾脏中均有表达。结果说明 ,携带人类HLA Ⅱ类DRα和DRB1 0 4 0 1基因的转基因动物模型构建成功。     

β2m基因敲除小鼠构建

β2m (Beta-2-microglobulin)基因编码一个非糖基化蛋白,作为主要组织相容性复合体1类 (MHCⅠ) 的重要组分,发挥抗原递呈的作用。为了避免免疫介导的清除,人类肿瘤和病原体采取了不同的策略,其中包括MHCⅠ表达的丢失。合适的动物模型对于评估和开发肿瘤及其他疾病的临床治疗新方法,以及阐明目前临床有效治疗方法的机制至关重要。利用CRISPR/Cas9基因编辑、显微注射等方法构建了β2m基因敲除小鼠。随后,通过PCR鉴定、qPCR、流式分析等实验技术进行基因型和表型鉴定。基因型鉴定结果显示在该品系小鼠中,目的基因编码区目标区域缺失。qPCR检测发现,β2m的mRNA水平发生显著的下调。流式结果显示,在不同的免疫组织和器官中,CD8+杀伤性T细胞显著减少。综上,成功构建β2m基因敲除小鼠,为后续体内研究β2m基因的功能奠定了基础。     

突变型p53Neu／erbB2双转基因鼠的培育—乳腺定位高表达突变型p53Neu／erb32

为了研究乳腺癌发生与发展过程中突变型p53和Neu基因之间的相互作用,我们构建了p53/Neu双转基因鼠。用5只成年雄性Neu转基因鼠与10只成年雌性p53转基因鼠交配,对150只雌性杂交后代鼠进行p53/Neu双转基因鼠的筛选。为此,本实验建立了PCR－一步鉴定法。即：在同一个反应管内能同时满足小鼠β－酪蛋白基因、p53基因和Neu基因上三个片段（分别为0．5kb、1.2kb、1.7kb）的扩增反应者被判定为双转基因鼠（Fig.1)。传统的Southern分析（Fig.2)与PCR一步法鉴定结果相吻合。证明：该法的准确率为100％,进一步、随机取样,Northern分析（Fig.3)表明：双转基因鼠（2号）在哺乳第二天即出现p53基因的高。继而、在姓娠第10、17天,哺乳第10、21天也检测到该基因的表达。另外,免疫组化染色也检测到了p53和Neu蛋白（未展示结果）。     

血管内皮细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

血管内皮细胞参与血管形成、血管稳态维持、血栓形成、炎症和血管重建等生理和病理过程。为了便于通过Cre-LoxP系统研究相关基因在血管内皮细胞中的功能,创建了Tie2-Cre转基因小鼠,利用Tie2基因的启动子驱动Cre重组酶基因在血管内皮细胞中表达。经基因组PCR和Southern Blot鉴定有6只小鼠在基因组上整合有Cre基因,整合率为11％。为了验证Cre重组酶的剪切活性和表达组织分布,我们将Tie2-Cre转基因小鼠分别与Smad4条件基因打靶小鼠和报告小鼠ROSA26交配。Tie2-Cre;Smad4^co/＋小鼠的多个组织的基因组DNA的PCR结果显示,Cre重组酶在所有包含血管内皮细胞的组织中表达并能介导LoxP间的重组。Tie2-Cre;ROSA26双转基因胚胎LacZ染色结果显示,Cre重组酶在所有被检测组织的血管内皮细胞中特异性表达。因此．Tie2-Cre转基因小鼠可作血管内皮细胞谱系分析和在血管内皮细胞进行条件基因打靶的理想工具小鼠。     

Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白转基因小鼠的建立

目的:建立Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的转基因小鼠。方法:用分子克隆的方法构建包括肺表面活性蛋白A(SP-A)启动子、SARS-CoVN蛋白基因、β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因和人生长激素(hGH)polyA的转基因载体pSP-A-N。以显微注射的方法将8.3kb的转基因片段引入小鼠受精卵。通过PCR、Southern印迹和LacZ染色检测子代小鼠中转基因的整合及表达。结果:共注射952枚受精卵,移植至42只假孕母小鼠的输卵管中发育,获得子代小鼠128只,经PCR、Southern印迹鉴定,其中11只小鼠基因组上整合有SARS-CoVN蛋白基因,整合率为8.6%。鉴定结果显示,11只转基因首建者小鼠中有1只表达外源基因并能正常传代。LacZ染色结果表明N蛋白基因在转基因小鼠Ⅱ型肺上皮细胞中特异表达。结论:成功构建了Ⅱ型肺泡细胞特异表达SARS-CoVN蛋白的转基因小鼠,为深入研究该基因的病理生理学效应奠定了基础。