人c-myc转基因细胞的建立

目的:建立人c-myc转基因细胞。方法:通过成功构建c-myc逆转录病毒表达载体,并经脂质体介导转染包装细胞293T,收集产重组病毒的293T培养上清,运用NIH3T3细胞测定了病毒滴度,用适当浓度的病毒感染L929细胞,经用Zeocin选择性培养基筛选细胞。结果:得到稳定高表达c-myc基因的L929转基因细胞。结论:运用逆转录病毒转染法可得到高表达的转基因细胞。     

Lats1基因敲除小鼠保种的研究

目的　以Lats1基因敲除小鼠为例 ,研究国家遗传工程小鼠资源库遗传小鼠的保种技术路线及方法。方法　采用了胚胎移植 ,目的基因检测 ,胚胎冷冻等技术。结果　在库内得到 2 4只Lats+ -小鼠 ,扩群后 ,冷冻保存 110枚胚胎。结论　上述方法能确保Lats1基因敲除小鼠资源库保种成功。     

kitl非编码区突变导致RNA剪切异常的小鼠

本文主要采用RT-RCR技术从kitl1-bao纯合子和正常C57BL/6(B6)小鼠总RNA中扩增出kitl基因片段,测序后与GenBank(登录号:NM.013598)序列比对,找到mRNA上突变部位。PCR扩增kitl基因组DNA上对应部位进一步测序验证。结果发现kitl1-bao突变纯合子kitl基因mRNA缺少第8号外显子。在基因组DNA上kitl基因第8号内含子第2个碱基由T转换为C,是引起mRNA剪接错误的原因     

复制型HBV转基因小鼠的遗传与繁育研究

本文采用类似系祖建系的方法,对复制型ＨＢＶ转基因小鼠模型的１７、２１、２５三个系列进行了繁育,通过ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子杂交的方法,检测三个系列小鼠尾组织和血清的ＤＮＡ样品,以确定ＨＢＶ基因的整合和复制情况。结果表明,ＨＢＶ基因已稳定地遗传至第五代（Ｆ５）,且各世代小鼠血清中都存在ＨＢＶＤＮＡ,此外,整合阳性小鼠的血清中能测出ＨＢＶＤＮＡ的比率很高,Ｆ１代为９４．４４％（１０２／１０８）,Ｆ２、Ｆ３代为９５．３１％（６１／６４）,故在繁育中可以通过测血清中的ＨＢＶＤＮＡ来确定小鼠是否整合。     

应用氯化锶对小鼠卵母细胞孤雌活化的研究

目的　探讨小鼠卵母细胞孤雌激活的最佳作用条件。方法　将MⅡ期小鼠卵母细胞随机分为 2组 ,第一组 ,将小鼠卵母细胞分别放入 2、4、6、8、10mmol ml不同浓度的氯化锶激活液中 ,作用 6h ,观察激活率及囊胚发育率。第二组 ,将小鼠卵母细胞放入 10mmol ml氯化锶激活液中 ,分别作用 3、6、9h ,观察激活率及囊胚发育率。结果　第一组 ,激活率分别为 86 49%、82 6 1%、88 0 0 %、86 6 7%、81 18%。各组间差异无显著性。体内培养 72h回收囊胚 ,囊胚发育率分别为 0、31 42 %、43 33%、6 2 5 0 %、5 0 0 0 %。 6～ 10mmol mlSrCl2 激活液激活后囊胚发育率高于 0～ 4mmol ml(P <0 0 5 )。第二组 ,激活率分别为 82 86 %、89 6 1%、91.40 %。 72h囊胚发育率分别为 2 6 5 3 %、5 0 0 0 %、5 3 2 2 %。激活 6、9h的囊胚发育率高于激活 3h的囊胚发育率 (P <0 0 1)。结论　结果表明 ,6～ 10mmol ml的SrCl2 为卵母细胞孤雌活化的最佳作用浓度 ,6～ 9h的激活时间为最佳作用时间 ;表明SrCl2 的浓度和作用时间对小鼠卵母细胞的活化有显著的影响。     

ENU诱导获得一种短尾小鼠及其突变基因的初步定位

用一种化学诱变剂ENU(乙酰基亚硝基脲 )腹腔注射 3 0只 8～ 1 0周龄C5 7BL 6J(简称B6)雄鼠 (G0代 ) ,6周后与同品系正常母鼠配种繁殖后代 (G1代 )小鼠 3 5 1只。对其后代进行筛选获得一种可遗传的显性短尾突变小鼠。为了定位该突变基因 ,运用平均分布于B6和DBA 2 (简称D2 )小鼠常染色体而在这两者间又有差异的 3 9个微卫星对突变小鼠的 (D2×B6)F1代短尾突变小鼠回交D2得到的有短尾表型的[(B6×D2 )F1×D2 ]F2 代小鼠进行基因组扫描。反向运用经典的位置候选基因法 ,将短尾突变基因定位于 1 7号染色体 ,与D1 7Mit3 3的LOD值为 9 0 8。选用该染色体上与短尾表型相关基因Brachyury (T)最近的微卫星D1 7Mit1 43引物扩增 ,在 1 0 9只F2 代短尾小鼠中未发生一例交换 ,表明Brachyury基因是本例短尾突变强有力的候选基因。     

表达siRNA的重组腺相关病毒载体的构建和鉴定

腺相关病毒(AAV)载体介导的RNA干扰(RNAi)可在哺乳动物细胞中长期特异性抑制同源基因表达。本研究以AAV Helper-Free System中的转移质粒pAAV-MCS为基础,引入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和H1启动子,将该质粒改造为可表达小干扰RNA(siRNA)和EGFP的质粒pAAV-EGFP-H1。该质粒与辅助质粒共转染包装细胞后,获得了具有感染性的重组AAV(rAAV)。以EGFP为靶基因的干扰实验证明:所得rAAV可以产生siRNA并能够特异性抑制EGFP靶基因表达;荧光显微镜观察、FACS分析和Real-time PCR方法均表明重组病毒rAAV-H1-sh EGFP引起EGFP的表达降低大于60%。     

snthr-1Bao稀毛小鼠的生物学特性

对稀毛小鼠snthr-1Bao和对照组DBA/2小鼠的生长情况、繁殖性能、形态学和大体解剖学进行了观察.结果表明snthr-1Bao小鼠的生长发育较DBA/2小鼠迟缓,被毛异常,呈稀疏状.在繁殖学特性方面,snthr-1Bao小鼠与DBA/2小鼠相比雄性睾丸组织绝对重量和脏器系数均比DBA/2小,差异呈极显著性(P＜0.01);断奶仔数比DBA/2小鼠少,差异呈极显著性(P＜0.01).对大体解剖学特性的观察表明,两种品系小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、脑等脏器的位置、形态结构无差异,但有些脏器的绝对重量和脏器系数存在品系间差异(P＜0.05或P＜0.01).血液生理指标方面两种品系小鼠相比在白细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜碱细胞的数量上存在差异(P＜0.01).因此,该突变不仅影响小鼠被毛的正常生长,还影响小鼠的生长发育、繁殖性能及血液生理指标.     

乙烷基亚硝基脲诱变获得两例新的被毛突变小鼠

采用乙烷基亚硝基脲 (Ethylnitrosourea ,ENU)诱变获得人类疾病的小鼠模型。用 1 0 0mg/KgENU腹腔注射 1 8只 8- 1 0周龄的雄性DBA小鼠 (G0 ) ,每周一次共三次 ;将在后代小鼠 (G1 )筛查到的突变个体与同品系配种 ,若异常表型传代则可能为显性突变 ;选择表型正常的G1 雄鼠与C5 7BL/ 6配种得F1 ,将F1 随机互交得到F2 ,依据F2 是否有突变鼠出现确定可能存在的隐性突变。结果表明 ,在 35 2只G1 小鼠中 ,1 4只出现异常表型 ,但均未传代 ;对 30只G1 雄鼠的隐性遗传试验获得 2只稀毛突变小鼠 ,均表现为被毛稀疏、幼鼠生长缓慢     

两种白斑小鼠突变基因的染色体定位

以本中心ENU诱变获得的两种白斑突变小鼠W-4Bao与Kitl-1Bao为研究对象[均为C57BL/6J(B6)背景],遗传试验表明它们都为单基因显性遗传,W-4Bao及Kitl-1Bao突变基因纯合子小鼠的表型分别为全白色及“黑头白”;将白斑杂合子小鼠与DBA/2(D2)交配获得具有白斑表型的F1小鼠,F1小鼠再回交D2繁殖[(B6×D2)F1×D2]F2小鼠,利用微卫星标记对F2代小鼠进行连锁分析。结果发现W-4Bao与微卫星D5Mit356、D5Mit308之间的LOD值分别为56.82、51.50,从而把该突变基因定位于第5号染色体D5Mit356与D5Mit308之间;Kitl-1Bao与微卫星D10Mit70、D10Mit68之间的LOD值分别为27.37、21.20,从而把该突变基因定位于第10号染色体上D10Mit70与D10Mit68之间。经过检索小鼠基因组数据库确认它们的候选基因分别为kit及kitl。