鸡球虫Etp28基因的克隆及其在杆状病毒系统中的表达

本文克隆了鸡柔嫩艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌａ）广东株子孢子折光体抗原Ｅｔｐ２８基因,与国外发表的柔嫩艾美耳球虫ＭｅｒｃｋＬＳ１８株比较,仅在第４９２位有一个属于同义突变的碱基变异（Ｃ→Ｔ）。随后在修饰的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＭＮＰＶ－ＯＣＣ－）载体系统中得到了高效表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明表达产物为５３ｋＤ的融合蛋白ＧＳＴ－６×Ｈｉｓ－Ｅｔｐ２８,其产物占细胞总蛋白量的２１．３％,在草地夜蛾培养细胞（Ｓｆ９）中的得量为０．４２ｍｇ／Ｌ×１０６个细胞。免疫保护效果实验初步结果表明该重组抗原能够提供一定的抗球虫保护作用。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中表达水平初探

将含有鸡传染性支气管炎病毒 Ｓ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的重组转移质粒ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 和ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ 分别与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ ,ｇａｌ＋ ） 共转染草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞,经空斑纯化得到重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 和 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。将重组毒株分别感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,并进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 检测。结果表明, Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 蛋白, Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后７２ ｈ Ｓ１ 蛋白的表达量占细胞内总蛋白量的３５ ．８ ％ ,而 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３） Ｓ１ ． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 感染的细胞内检测不出 Ｓ１ 蛋白。经分析认为这一差异主要来自 Ｓ１ 基因翻译起始位点及其附近的周围环境。     

抗癌胚抗原单链抗体基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ, 与修饰的家蚕核型多角体病毒ＢｍＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡＳｃＦｖ 基因的重组病毒ＢｍＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为２８ｋＤ, 前者占细胞总蛋白的６ ％ , 后者为０ ．３ ｍｇ／ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ｎｉ２＋ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱纯化, 前者纯度可达９０％ 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有ＣＥＡ 结合活力, 其亲和常数分别为５ ．４×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 和２．３ ×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－１ , 略低于其亲本单抗Ｅ７Ｂ１０ ２．７ ×１０９／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 。     

日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术,以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板,经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）７０的启动子下游,再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中,得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原,所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见,Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．     

人肝癌组织中的一个Lis1基因的阅读框移码突变

将ＧＳＴ融合蛋白表达与蛋白质截短检测法（ＰＴＴ）法相结合,检测Ｌｉｓ１基因在肝癌组织中的阅读框移码突变。即从肝癌组织中通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增的Ｌｉａ１基因克隆人ＧＳＴ融合蛋白表达载体ｐＧＥＸ０１,并于大肠杆菌ＤＨ５α中进行表达。通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳发现肝癌组织中有截短的ＧＳＴ－Ｌｉｓ１融合蛋白,大小为３３ＫＤ,而全长融合蛋白大小应为７１ＫＤ。经测序验证,发现产生截短蛋白的Ｌｉａ１基因在第１６３位     

汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆,序列分析及表达

从汉坦病毒陈株感染的ＶｅｒｏＥ６细胞裂解液中提取病毒ＲＮＡ,经逆转录ＰＣＲ获得病毒Ｓ基因编码区约１．３ｋｂｃＤＮＡ片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒７６１１８株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为８６％,推导的氨基酸序列同源性为９７％。将该基因片段插入原核表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ１,在大肠杆菌中获得高效表达。表达产物为ＧＳＴＮＰ融合蛋白。ＳＤＳＰＡＧＥ检测表达蛋白分子约７２ｋＤ左右。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ和ＥＬＩＳＡ试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的ＭｃＡｂ发生反应,其抗原表位及ＭｃＡｂ反应谱与７６１１８株相比存在某些差异。     

蛋白激酶C对鼻咽癌细胞P21~(ras)表达的影响

使用蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）抑制剂与抗Ｐ２１Ｈ－ｒａｓ单抗,通过免疫细胞化学,双参数流式细胞仪等方法,探讨鼻咽癌细胞ＣＮＥ－２Ｚ中ＰＫＣ与Ｈ－ｒａｓ表达的关系。结果：１）Ｐ２１ｒａｓ蛋白在ＣＮＥ－２Ｚ细胞主要在胞膜（２７％）与胞浆（９３．７％）表达。作用于ＰＫＣ调节区的抑制剂ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ（ＳＳ）（２×１０－５ｍｏｌ／Ｌ）与作用于催化区的ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（ＳＴ）（２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ）在明显抑制细胞生长的浓度使Ｐ２１ｒａｓ表达程度均减弱,胞膜阳性率明显降低,分别为５．６％与１．６％。２）蛋白质－ＤＮＡ双参数流式细胞法测定发现在Ｇ１期细胞群Ｒａｓ蛋白表达差异较大,提示Ｒａｓ蛋白主要在Ｇ１期合成逐渐增多;经ＰＫＣ抑制剂ＳＳ与ＳＴ处理后,Ｇ１期细胞表达的差异减小,说明ＰＫＣ抑制剂抑制了Ｇ１期Ｒａｓ蛋白合成。本研究结果提示：ＰＫＣ对Ｒａｓ蛋白向发挥作用的部位胞膜的转移具有一定的调控作用。Ｒａｓ蛋白的表达可能与ＣＮＥ－２Ｚ细胞Ｇ１／Ｓ期的过渡有关。     

抗品胚抗原单链抗休基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫ－Ｈｉｓ,与修饰的家蚕核型多角体病毒Ｂｍ－ＢａｃＰＡＫ ＤＮＡ共转染家蚕细胞,经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡ ＳｃＦｖ基因的重组病毒Ｂｍ－ＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫,在两者中均得到了高效表达,产物分子量为２８ｋＤ,前者占细胞总蛋白的６％,后者为０．３ｍｇ／蚕。目的基因在家蚕细胞和     

人T细胞白血病病霉Ⅰ型env基因的克隆与表达

本文通过聚合酶链式反应（ＰＣＲ）,从整合有人Ｔ细胞白血病病毒Ⅰ型（ＨＴＬＶ－Ｉ）的ＭＴ－２细胞株中,扩增出ＨＴＬＶ－Ｉ外膜蛋白（ｅｎｖ）的全基因（１．４５ｋｂ）,并成功地克隆入ｐＵＣ１９载体,构建成ｅｎｖ基因克隆ｅｎｖ／ｐＵＣ１９．利用原核高效表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ,在大肠杆菌中有效地表达了与谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）融合的ｅｎｖ羧基末端抗原的重组蛋白,融合基因的转录由ｔａｃ启动子调控。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明,有一约５２ｋＤ的目的蛋白带,表达量占菌体总蛋白的１０％;ＷｅｓｔｅｒＮｂｌｏｔｔ及ＥＬＩＳＡ结果显示,表达产物能与ＨＴＬＶ－Ｉ多抗血清结合。本研究为研制ＨＴＬＶ－Ｉ的诊断试剂及进一步了解ｅｎｖ的免疫学和生物学性质打下了基础。     

湖南尖吻蝮蛇毒两个出血毒素的纯化和理化性质

经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤,ＱＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０和ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－２５离子交换层析的步骤,从湖南产尖吻蝮（Ｄｉｅｎａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎａｃｕｔｕｓ）蛇毒中纯化出两个出血毒素（ＤａＨＴ－１和ＤａＨＴ－２）．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得分子量均为２３．５ｋＤ,ＩＥＦ－ＰＡＧＥ测得等电点分别为５．６和５．２,两者具有相似的氨基酸组成,其中酸性氨基酸（Ａｓｘ,Ｇｌｘ）分别占２３％和２４％,ＤａＨＴ－１和ＤａＨＴ－２的最小出血剂量（ＭＨＤ）分别为０．５μｇ和０．８μｇ。都具蛋白水解酶活性,无对ＴＡＭＥ,ＢＡＥＥ的水解活性和ＰＬＡ２酶活性．两者的蛋白水解酶活力与出血活性并非正相关．ＤａＨＴ－１和ＤａＨＴ－２的最适温度分别为３５℃和４０℃,最适ｐＨ为６－９,对热均不稳定,温度高于６０℃活性完全丧失。金属离子的分析显示每摩尔毒素蛋白约含０．５ｍｏｌ的Ｚｎ,１ｍｏｌ的Ｃａ,较多的Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ,不含Ｃｏ。     

抑瘤素-M(OSM)在GST融合表达系统中的表达、纯化和活性测定

抑瘤素Ｍ是一种具有多种生物活性的细胞因子,具有重要的研究价值和潜在的应用前景。基于ＧＳＴ融合表达载体,构建了一个ＯＳＭ的高效表达系统,诱导表达后融合蛋白占全菌蛋白的５０％以上,在低温诱导的条件下,可溶性蛋白中融合蛋白的含量可达１５％。在对包涵体形式的融合蛋白变复性的基础上,通过亲和层析一步纯化达到９０％左右的纯度。对融合蛋白进行了活性测定,结果提示了Ｎ端的头两个氨基酸对ＯＳＭ的生物活性是重要的。     

An efficient expression system for the production of functionally active human LKB1

Human LKB1, also known as STK11, is a tumour-suppression protein that mediates important functions in cellular proliferation and polarization. It might constitute an important target in cancer therapy. In order to produce large amounts of recombinant protein for biochemical and functional studies, a full-length cDNA clone was subcloned and expressed in Escherichia coli and insect cells. Although fusion proteins corresponding to LKB1 with 6xHis, GST and MBP tags could be overexpressed in E. coli, only MBP-LKB1 was recovered in a soluble, but heavily degraded form. Further studies demonstrated that this protein was not functional. Subsequent expression in insect cells of LKB1 with 6xHis and GST tags yielded insoluble products also. However, when chaperones Hsp70 and its cofactors Hsp40 and Hsdj were co-expressed with GST-LKB1, a clear increase in the solubility of the final protein was obtained. Moreover, this soluble, purified recombinant GST-LKB1 demonstrated to be a phosphoprotein, with at least residue Ser325 phosphorylated. The purified protein was functionally active as being able to demonstrate autophosphorylation in the absence of any associated kinase.     

GST-HAI-1融合蛋白的表达及抗人HAI-1单克隆抗体的制备

制备抗人肝细胞生长因子激活物抑制因子（HAI-1）单克隆抗体,为对HAI-1进行进一步的研究打下基础。将人HAI-1 cDNA分段克隆,构建GST-HAI-1融合蛋白原核表达载体,转化大肠杆菌后加IPTG诱导融合蛋白表达,经制备型SDS-PAGE法分离表达的GST-HAI-1融合蛋白,通过割胶、电洗脱回收融合蛋白,并以此为抗原免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术制备产生抗人HAI-1单克隆抗体的杂交瘤,以ELISA、Western blot和免疫组织化学染色进行鉴定。最终获得抗人HAI-1单克隆抗体杂交瘤细胞株ZMC6,产生的单克隆抗体可特异性地与表达的GST-HAI-1融合蛋白反应,并可识别大肠组织中的膜型及脱落型HAI-1蛋白。该单克隆抗体的制备成功,为深入研究HAI-1的功能提供了有力工具。     

蓝藻抗病毒蛋白-N基因的克隆、表达、纯化及活性鉴定

蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N,CVN)具有强效抗HIV及其他包膜病毒活性,该蛋白序列特殊,难以重组制备,在大肠杆菌细胞质中形成包涵体。本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对CVN原始核苷酸序列进行优化,通过多次PCR合成SUMO-CVN的全长DNA序列,构建pET3c-SUMO-CVN重组表达质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株。通过对诱导剂浓度和诱导时间的优化,发现以0.5mmol/LIPTG在20℃诱导24h可获得最高表达,SDS-PAGE结果显示,SUMO-CVN为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的28%;经特异性的SUMO蛋白酶对融合蛋白进行酶切及两步Ni-NTA凝胶亲和层析可以得到纯度较高的重组CVN蛋白。ELISA结果表明,重组蛋白CVN与gp120蛋白有较高的亲和力。体外抗病毒活性实验表明,重组蛋白CVN在纳摩尔浓度具有很好的抗HSV-1和HIV-1/ⅢB活性;这为开发基于CVN的新型、高效抗病毒药物打下了基础。     

血管抑制素功能结构域K1与PKA底物磷酸化基序的融合表达及磷酸化标记

通过 RT- PCR,从人肝组织中扩增出血管形成抑制素 ( angiostatin) c DNA的 K1片段 ,经DNA序列分析证实其正确性 ;将 K1与 GST融合并带上 1 7个氨基酸的 PKA底物磷酸化基序 ,IPTG诱导表达 ,以还原型谷胱甘肽偶联的琼脂糖凝胶亲合层析直接从细菌裂解上清中纯化融合蛋白 ;以 PKA催化单位将 3 2 P通过磷酸化作用标记至纯化的蛋白 ,再用凝血酶切去 GST,进行SDS- PAGE.放射自显影结果显示 ,GSTag- K1和 Tag- K1分别在 40 k D和 1 7k D处有信号强而特异的显影条带 ,表明带有磷酸化序列的蛋白能够被 PKA特异地磷酸化标记     

棉铃虫组织蛋白酶B多克隆抗体制备及鉴定

介绍了用重组的棉铃虫组织蛋白酶B(HCB)制备兔多克隆抗体的方法。用已经克隆得到的pGEX 4T 1 HCB重组质粒转化的大肠杆菌 (Escherichiacoli)BL2 1菌株进行诱导表达 ,获得融合表达的包涵体产物。经过变性、复性等方法处理包涵体 ,获得可溶性融合蛋白。用凝血酶裂解融合蛋白 ,再经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化目的蛋白HCB ,用做抗原免疫家兔。产生的抗血清经硫酸铵沉淀 ,最后得到了抗棉铃虫组织蛋白酶B的多克隆抗体。用间接酶联免疫吸附测定法测得该抗体对重组表达的组织蛋白酶B和棉铃虫体内的组织蛋白酶B的效价分别为 1∶5 1 2 0 0和 1∶2 5 60 0。通过免疫印迹检测证明此抗体不仅可以识别重组表达的棉铃虫组织蛋白B ,而且可以识别棉铃虫卵巢匀浆液中的棉铃虫组织蛋白酶B。     

可溶性VEGF受体Flt-1的基因克隆及其活性产物在原核中的表达

可溶性血管内皮细胞生长因子受体 ( Flt- 1 )具有受体拮抗剂作用 ,可竞争结合血管内皮细胞生长因子 ,( VEGF)并与其膜表面受体 Flt- 1及 KDR形成异源二聚体 ,最终阻断 VEGF的生物学活性 .利用 RT- PCR技术从人脐静脉内皮细胞扩增出 Flt- 1胞外 ～ 区 c DNA片段 ,通过基因重组将该片段克隆于谷胱甘肽转移酶 ( GST)融合蛋白表达载体 PGEX2 -T中 ,连接产物转化大肠杆菌XL1 - blue,经 IPTG诱导可获大量稳定表达的 Flt- 1 - GST融合蛋白 .该表达产物经变性复性处理后 ,可特异性结合 12 5 - VEGF.大量具有活性的可溶性 Flt- 1的获得有助于新的抗肿瘤血管形成方法的探索 .     

MutL融合蛋白的高效表达及其伴侣功能研究(英文)

DNA错配修复蛋白MutL和其它的修复蛋白相互作用来共同完成大肠杆菌甲基介导的错配修复过程 .为研究修复蛋白MutL的体外生物功能构建了融合蛋白Trx His6 Linkerpeptide MutL(THLL)的表达载体并使其高效表达及易于纯化 .mutL基因片段是以E .coliK 12基因组为模板经PCR扩增获得 ,并通过基因的体外拼接成功构建了融合蛋白THLL表达载体pET32a linkerpeptide mutL .重组菌株E .coliAD4 94 (DE3) pET32a linkerpeptide mutL经过IPTG的诱导表达了融合蛋白THLL .收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS PAGE分析 ,结果表明有一与预期分子量(84kD)相应的诱导表达条带出现 ,其表达量约占全细胞蛋白的 30 %且以可溶形式存在 .利用固定化金属离子 (Ni2 +)配体亲和层析柱纯化融合蛋白THLL ,其纯度达到 90 % .通过非变性凝胶电泳分析 ,对融合蛋白THLL在DNA错配修复过程中的分子伴侣生物功能进行了系统研究 .结果表明 ,THLL能增加融合蛋白Trx His6 Linkerpeptide MutS (THLS)与含有错配碱基DNA双链的结合 ,但受ATP的浓度变化影响很大     

霍乱毒素B亚单位基因（CtxB）的克隆及其表达

从霍乱弧菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＥＲ方法获取霍乱毒素Ｂ亚单位基因（ＣｔｘＢ）。序列分析结果表明,ＣｔｘＢ基因编码１２４个氨基酸,其中编码６２位Ｔｈｒ的密码子与文献报道有差异。将ＣｔｘＢ基因插入质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２,构建ｐＧＥＸ－ＣＴＸＢ表达质粒,转化大肠相菌ＢＬ２１（ＤＥ３０,筛选表达菌株ＣＴＸＢ／ＢＬ２１。工程株经ＩＰＴＧ诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,融合蛋白分子     

sTRAIL基因的表达、纯化及其生物学活性的初步研究

在原核表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(sTRAIL)分子,纯化表达产物,并进行初步的生物学活性的研究中,通过提取外周血淋巴细胞总RNA进行RT—PCR克隆sTRAIL cDNA,构建sTRAIL的原核表达载体,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定,IPTG诱导表达。以发酵罐放大培养,SDS-PAGE和Western-blot确认表达,用亲和层析和阳离子层析纯化表达产物,使用L929、Qay肝癌、K562人白血病等肿瘤细胞鉴定活性。结果发现重组表达的sTRAIL融合蛋白占总蛋白的39％,单纯蛋白纯化后纯度达95％,用抗人TRAIL多抗可以确认表达了TRAIL分子,能诱导几株肿瘤细胞凋亡。原核表达系统正确表达了TRAIL分子,并摸索了中试生产的条件,为其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。