霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＲ的方法扩增ｚｏｔ基因。序列分析表明,ｚｏｔ基因编码３９９个氨基酸,其中４个氨基酸与文献报道有差异。将ｚｏｔ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－２８（ａ＋）构建表达质粒ｐＥＴ－ＺＯＴ,转化大肠檑菌ＢＬ２１（ＤＥ３）筛有达菌株ＢＬＺＯＴ。表达菌株经１ｍｍｏｌ／ＬＴ ＩＰＴＧ诱导表达３－５ｈ后,表达大量ＺＯＴ蛋白,并形成包涵体,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重组ＺＯＴ蛋白分     

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和ＤＮＡ体外重组方法,克隆出５７９ｂｐ的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ４ｂ基因片段,插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－２８ａ中,构建重组质粒ｐＥＴ／ＮＳ４ｂ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,经ＩＰＴＧ诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在３０ｋＤ处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化目的的蛋白,ＥＬＥＳＡ检测结果表     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

大肠杆菌cai DE的基因克隆与表达

从Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ４１００菌体的染色体ＤＮＡ中利用鸟枪法克隆含编码肉碱消旋酶及相关因子的ｃａｉＤＥ基因片段,并经序列分析验证,由重组质粒ｐｌＸ３９３亚克隆得到ｐＤＳＷ２重组表达质粒,后者转入Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中是丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,在聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上分子量为３０ｋＤ和２４ｋＤ附近可见明显的表达蛋白带。     

小麦丛矮病毒M蛋白基因的序列测定,表达和鉴定

从小麦丛矮病毒（ＷＲＳＶ）基因文库含磷蛋白ＮＳ基因的质粒中,经亚克隆、测序,得到ＮＳ蛋白基因的下游序列,其中含有一读框４５３ｎｔ、编码一分子量约１７ｋＤ蛋白。用ＰＣＲ方法获得该读框全长片段并克隆到表达载体ｐＧＥＸ－３Ｘ,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中以ＩＰＴＧ诱导表达,产物由谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）亲和层析柱纯化后,用蛋白质印迹分析鉴定,结果表明,该读框为编码病毒基质蛋白Ｍ的基因。     

日本血吸虫(中国大陆株)谷胱甘肽转移酶编码区基因的体外扩增、克隆及在原核细胞的高效表达

为表达、获取日本血吸早谷胱甘肽转移酶（ＳｊＧＳＴ）基因工程重组蛋白,以日本血吸虫（中国大陆株）ｃＤＮＡ为模板,设计、合成特定寡核苷酸引物,ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ编码基因序列,将扩增产物连接ｐＧＥＭ－Ｔ克隆载体,再亚克隆到真、原核表达质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ中,转染大肠杆菌ＸＬ１－ｂｌｕｅ,经ＩＰＴＧ诱导后用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表达效果。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出日本血吸虫ＧＳＴ编码区基因片段,其     

Mn-SOD与抗癌胚抗原单链抗体基因的融合及高效表达

将Ｍｎ－ＳＯＤ与抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因（Ｓｃ－Ｆｖ ｇｅｎｅ）融合,重组到含Ｔ７启动子的表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）中,构建表达质粒ｐＥＴＭｎ－ＳＯＤ－ＳｃＦｖ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行高效表达,表达物占菌体可溶性总蛋白的２４％。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和蛋白质和迹图谱显示表达物分子量为４５ｋＤ与融合基因编码蛋白质的理论值相符。该蛋白质在大肠杆菌中为泌型表达有利于纯化。ＲＩＡ测定表     

人GM—CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达

从诱导的人胚肺细胞ＨＦＬ株中提取总ＲＮＡ．经ＲＴ－ＰＣＲ反应获取了人ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ,ＤＮＡ序列测定表明其顺序与文献报道完全一致。为了获得高效表达,应用ＰＣＲ改造了人ＧＭ－ＣＳＦ的ｃＤＮＡ５’端核苷酸序列,并将改造的人ＧＭ－ＣＳＦ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－１１ｄ构建成表达质粒ｐＥＴＣ－５,将此质粒转化大肠杆菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）得到表达菌株ＢＬＥＣ４。表达菌株用０．５ｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导２小时后,产生大量重组蛋白并形成包涵体。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳图谱扫描结果表明,ｒｈＧＭ－ＣＳＦ产量占菌体总蛋白量的１６％。ＥＬＩＳＡ和ＴＦ－１细胞培养测定表明,初步纯化和复性的ｒｈＧＭ－ＣＳＦ具有天然的ｈＧＭ－ＣＳＦ生物活性。     

日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术,以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板,经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）７０的启动子下游,再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中,得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原,所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见,Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．     

HIV-1型核衣壳蛋白P24截短体在大肠杆菌中的表达,纯化和鉴定

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ １ｇａｇ基因中扩增出衣壳蛋白Ｐ２４截短体（ｔＰ２４）基因,插入质粒ｐＧＥＸ ４Ｔ３中构成重组表达质粒ｐＧＥＸ ｔｐ２４,将ｐＧＥＸ ｔｐ２４转化大肠杆菌ＢＬ２１后获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白量的３４３８％。经Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化的截短体Ｐ２４纯度为９２７７％。纯化的截短体Ｐ２４在间接ＥＬＩＳＡ和免疫印迹检测ＨＩＶ抗体阳性血清和正常人血清中,具有很高的抗原特异性和免疫反应性。     

HIV—1 P24截短体与gp41截短体的融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

用基因重组技术将截短的HIV－1 p24基因和gp41基因连接成嵌合基因,插入质粒pGEX-4T3,构建成重组表达质粒pGEX-F。将pGEX-F转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导表达,pGEX-F在大肠杆菌BL21中获得了高效表达。融合蛋白P24－gp41经Glutathione-Sepharose4B亲和层析纯化后,用间接ELISA和免疫印迹检测HIV抗体阳性血清和正常人血清,P24－gp41只与HIV抗体阳性血清反应,证明获得的融合蛋白P24－gp41有很强的抗原特异性和免疫反应性,具有较高的应用价值。     

口蹄疫病毒P1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒 (FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pGEX KG中 ,使P1基因与GST融合 ,获得融合表达质粒pKG P1,转化E .coliBL₂₁ (DE3) ,经IPTG诱导 ,SDS PADE结果表明GST P1融合蛋白获得高效表达 ,Western blot检测证实表达的融合蛋白具有免疫学活性 ,表达产物主要存在于细菌裂解液上清中。进一步采用GST纯化试剂盒纯化P1蛋白并作为诊断抗原 ,建立了P1 ELISA诊断方法 ,与FMD间接血凝 (IHA)检测方法平行检测 86 4份血清样品 ,总的符合率达87%。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测

通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA, 克隆到pGEM-T载体, 构建重组质粒pGEM-T-IL18, 转化E.coli JM109感受态细胞, 取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明, pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp, 编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中, 构建重组质粒pGEX-IL18, 转化E.coli BL21感受态细胞, 用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白, 占菌体总蛋白的28%左右, 以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤, 用MTT法测定表明, 重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白的原核表达与鉴定

本研究在大肠杆菌BL21中融合表达人乳头瘤病毒16型E7蛋白,并初步评价其应用价值。采用PCR技术扩增出HPV16E7基因,将其克隆进原核表达载体pGEX6p-1,转化至大肠杆菌BL21,利用IPTG进行诱导表达。以纯化的融合蛋白作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测重组李斯特菌(Lm1-2-E7)免疫小鼠后的E7血清抗体水平。在25℃,0.5mM IPTG诱导下,HPV16E7蛋白在大肠杆菌BL21中获得表达,融合蛋白以可溶性形式存在,Western blot结果显示其与HPV16E7单克隆抗体发生特异性反应。二次免疫后小鼠血清经间接ELISA结果表明E7特异性抗体滴度为1∶200。结果表明GST-E7融合蛋白具有较强的免疫活性。     

人乳头瘤病毒6型L1基因的克隆及蛋白表达

目的：在大肠杆菌中表达经密码子优化的人乳头瘤病毒6型（HPV6）L1的融合蛋白。方法：PCR方法扩增HPV6 L1,基因,测序及序列比对后,对基因进行密码子优化并合成优化后的基因HPV6mLI,将其克隆入原核表达载体pGEX4T-1,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,SDS-PAGE鉴定表达产物。结果：酶切和测序结果证实HPV6 mL1基因的原核表达载体构建正确;以1mmol／L IPTG于37℃诱导4h,蛋白以包涵体形式表达;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为80000。结论：获得大肠杆菌表达的HPV6L1蛋白,为其结构功能研究和疫苗研发提供了基础。     

水稻rab5B基因在大肠杆菌中的表达、纯化和GTP结合分析

Rab5B类蛋白因为其编码产物的N端具有特殊结构而被认为是一类特殊的蛋白质.水稻rab5B基因Osrab5B是这类蛋白质基因在单子叶植物中的首例发现.将Osrab5B基因的编码序列按正确读码框重组到具有谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase, GST）融合标签的pGEX-4T1表达载体中,转化大肠杆菌,获得了稳定表达目标融合蛋白的菌株,经GSTrap^TM柱纯化,获得了纯化的目标融合蛋白.GTP结合试验表明,在原核细胞中表达出的GST-OsRab5B融合蛋白具有体外结合GTP的能力.     

凋亡素融合蛋白的可溶性表达及活性分析

目的:构建PET-28a-SPA原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现其高效可溶性表达,测定对肿瘤细胞的凋亡效果。方法:本实验在获得凋亡蛋白融合基因的基础上,成功地构建了重组表达质粒PET-28a-SPA,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western blot检测,并采用MTT法检测其对肿瘤细胞的增殖抑制。结果:表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,软件分析表明表达蛋白占菌体蛋白20%左右。上清表达量约为10%。上清蛋白经纯化后,Western blot结果显示,利用凋亡蛋白单克隆抗体可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合,并且对A549肺癌细胞及Hela细胞具有一定的凋亡作用。结论:所获凋亡蛋白以高效胞质可溶形式表达,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。     

幽门杆菌Catalase/GST融合蛋白的表达、标签切除及鉴定

旨在利用GST融合基因表达系统表达幽门螺杆菌Catalase融合蛋白,并利用凝血酶切除GST标签.将重组质粒Catalase/pGEX-4T-1转化大肠杆菌BL21( DE3)感受态中,用IPTG进行诱导表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌后,Catalase/GST融合蛋白以部分可溶性的形式表达在上清中.采用谷胱甘肽琼脂糖树脂Glutathione Sepharose 4B对其进行纯化,得到Catalase/GST融合蛋白,再用凝血酶进行GST标签的切除,所得产物进行Western blotting鉴定.高效表达出Catalase/GST融合蛋白的相对分子质量约85 kD,凝血酶成功地切除了GST标签,Western blotting证实Catalase蛋白能被鼠抗Catalase单克隆抗体识别.