云南番木瓜环斑病毒的发生及遗传多样性

【目的】明确云南省番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)发生情况,并对其进行遗传多样性分析。【方法】利用RT-PCR技术,于2011-2012年对采自云南省昆明市、楚雄州、保山市、德宏州、西双版纳州、临沧市、玉溪市、红河州、文山州等地的24个番木瓜、南瓜和罗汉果疑似病样进行扩增、测序,对样品中获得的940 bp PRSV部分cp基因及3′端非编码区的序列应用分子生物学软件MEGA 5进行系统发育分析。【结果】从17个样品中检测到了PRSV,检出率为70.8%,表明该病毒在云南的发生较为普遍。云南PRSV不同分离物间的核苷酸序列变异较大,与其他已报道的PRSV分离物之间的基因组3′端核苷酸序列一致性为81.7%-100%。基于PRSV的CP部分氨基酸序列及基因组3′端核苷酸的系统进化分析结果表明,来自亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲的PRSV分离物可以分为2个组,其中第Ⅰ组均为来自中国的分离物,包括了大部分的PRSV云南分离物,第Ⅰ组内分离物间的差异较第Ⅱ组大;第Ⅱ组的分离物来源较为复杂,亚洲、北美洲、南美洲和大洋洲均有分布。基于PRSV CP部分氨基酸序列构建的系统进化树中,各分离物之间没有明显的地理和寄主相关性,而基于PRSV基因组3′端核苷酸序列构建的系统进化树中,除中国大陆分离物和印度分离物外,其他地区的PRSV在进化上与其地理来源有明显的相关性。【结论】PRSV在云南的昆明市、楚雄州、保山市、德宏州、西双版纳州、临沧市、玉溪市、红河州和文山州等地都有不同程度发生,且为害寄主植物涉及番木瓜、南瓜及罗汉果,PRSV侵染罗汉果为云南首次发现。云南PRSV分离物的分子变异很大,但是关于PRSV的分子变异是否与其地理分布及症状表现有关,以及P型和W型的分子区分特征还有待进一步研究。     

芜菁花叶病毒的3’末端序列克隆与CP基因序列分析

目的:克隆芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的3'末端序列,并进行CP基因序列分析.方法:以TuMV杭州榨菜分离物(TuMv-HZZC)接种病叶为材料,利用病毒粒子吸附法制备病毒RNA模板,经RT-PCR扩增获得了TuMV-HZZC 3'末端序列,将其克隆到PMD 18-T质粒上进行序列分析.结果:TuMV-HZZC分离物3'末端序列包括部分的Nib基因、完整的TuMVCP基因和3'-UTR,CP基因为864bp,分别编码288个氨基酸,3'-UTR序列(不包括PolyA尾巴)为213bp.经过与其他TuMV分离物的CP基因核苷酸和氨基酸比较,同源性分别达到88.0%～97.6%和91.0%-96.5%.结论:TuMV的系统进化具有典型的地域和寄主关联性.     

我国水稻条纹病毒一个强致病性分离物的RNA4序列测定与分析

对我国水稻条纹病毒(Rice Stripe Virus,RSV)一个强致病性分离物(辽宁PJ分离物)的RNA4区段进行扩增、克隆和测序,其核苷酸序列全长2157bp。与已报道的日本T和M分离物及我国云南CX分离物的RNA4序列进行比较分析,结果表明,这4个分离物可分为两组,其中,PJ、T和M分离物为一组,组内分离物之间,RNA4的毒义链(vRNA4)及RNA4的毒义互补链(vcRNA4)上的ORF的核苷酸一致性分别为970%和970%～975%,5′末端和3′末端非编码区的序列则完全一致。但PJ分离物与T分离物的亲缘关系更为密切,其基因间隔区(IR)与T分离物的等长,核苷酸一致性为930%,比M分离物的IR多了一段长19bp的插入序列,核苷酸一致性仅为850%。另一组为我国CX分离物,组与组之间,vRNA4及vcRNA4上的ORF的核苷酸一致性分别为940%和925%～935%,但在氨基酸水平上则没有明显的差异。CX分离物的IR与PJ分离物相比有一段长84bp的插入序列,组间,IR的核苷酸一致性仅为720%～750%,5′末端非编码区的序列完全一致,但3′末端非编码区有两个碱基的差异。这些结果表明,RSV在自然界的分子变异与其地理分布具有密切的关系。此外,非编码区序列的高度保守性暗示着它们在病毒基因转录和复制的调控方面具有重要的功能。本文还讨论了RSV的分子流行学。     

水稻条纹病毒中国分离物和日本分离物RNA2节段序列比较

测定了来源于我国水稻条纹叶枯病常年流行区的云南楚雄(CX)及病害暴发区的江苏洪泽(HZ)的水稻条纹病毒(RSV)2个分离物RNA2全长序列,其长度分别为3506bp和3514 bp.与已报道的日本T和O分离物RNA2序列进行比较的结果表明,这4个分离物可分为两组,其中,HZ、T和O分离物为一组,组内分离物之间,RNA2的毒义链(vRNA2)及RNA2的毒义互补链(vcRNA2)上的ORF的核苷酸一致性分别为97.2%～98.0%和96.8%～97.1%,5′端和3′端非编码区的序列则完全一致.但HZ分离物与T分离物的亲缘关系更为密切,其基因间隔区(IR)与T和O分离物的等长.另一组为我国CX分离物,组与组之间,vRNA2及vcRNA2上的ORF的核苷酸一致性分别为95.0%～95.7%和93.9%～94.4%.CX分离物的IR与HZ分离物相比缺失了一段8 nt的片段.5′端非编码区的序列完全一致,但3′末端非编码区有一个碱基的差异.这些结果表明,RSV在自然界的分子变异与其地理分布具有密切的关系.此外,非编码区序列的高度保守性暗示着它们在病毒基因转录和复制的调控方面具有重要的功能.本文还讨论了RSV的分子流行病学.     

甘蔗花叶病毒3’末端基因的克隆及外壳蛋白序列分析比较

选取我国SCMV优势株系A株系的分离物SCMV-CA为材料,经过病毒和病毒RNA的提纯,反转录获得病毒cDNA,并克隆到载体pUC19的SmaI位点上,筛选得到多个重组质粒。选取其中一个克隆SCMV-CA54进行测序,得到一个全长为1296 bp的核苷酸序列。这段序列由一个长为1044 bp的开放阅读框架（ORF）和一个长279 bp的3’末端非编码区序列（3'-UTR）及poly(A)尾巴组成。这个ORF包括病毒完整的外壳蛋白（CP）及部分核内含体蛋白b（NIb）基因序列。将所得序列同已知SCMV亚组中各株系分离物的核苷酸和氨基酸进行同源性比较,结果表明该序列与其它株系分离物CP核苷酸序列的同源性介于63.7%～77.6%之间,氨基酸的同源性介于64%～89%之间。根据马铃薯Y病毒属的序列同源性划分标准,SCMV-CA与其它株系或分离物的同源性关系均介于种与株系划分标准之间。这是我国首次报道SCMVCP基因序列。     

番木瓜环斑病毒华南强株系cDNA文库的构建及其基因组3''''端区域结构的研究

以λ-ZAPⅡ噬菌体为载体,构建了番木瓜环斑病毒华南强株系(PRV-SM)基因组cDNA文库。以PCR扩增的外壳蛋白(CP)基因为探针筛选出阳性克隆。酶谱和序列分析确定,其中两个阳性克隆除重叠部分外为长达2676个核苷酸的基因组3′端区域。其中包括棱内含体蛋白b(NIb)基因的1607个棱苷酸,CP基因的858个核苷酸和基因组3′端非编码区的211个核苷酸(不包括polyA尾巴)。PRV-SM的NIb含有依赖于RNA的RNA聚合酶的8个特征性保守序列,可能是参与基因组RNA复制的核心亚基。与其他株系比较,NIb的氨基酸变化主要集中在其C端和N端。PRV-SM 3′端非编码区有一段28个核苷酸的正向重复序列,能在其内形成茎环二级结构,并且在各株系间具有高度保守性。NIb,CP和3′端非编码区的总的序列比较表明,SM株系与国外报道的其他株系亲缘关系相对较远。     

百合斑驳病毒浙江分离物的基因组3′端序列分析

经RT-PCR扩增从浙江丽水的亚洲百合［Lilium cvs.(Asiatic Hybrids)］获得2个Potyvirus病毒分离物G和X的3′端cDNA片段,序列分析表明均为百合斑驳病毒（Lily mottle virus,LMoV）;将12个来源于不同地区百合与郁金香上的Potyvirus分离物进行序列同源性比较和系统进化树分析,结果表明G、X、ML61、1229、2b、MD、HZ、J这8个分离物的CP核苷酸序列同源性达85.9%～100%,在进化树中聚集成簇,归为LMoV;2b2、TM和TBV1 3个分离物同源性达91.2%～99.3%,在进化树中也单独成簇,归为郁金香碎色病毒（Tulip breaking virus,TBV）;2b3 与其它11个分离物同源性在74.4%～79.8%之间,为伦布兰特郁金香碎色病毒（Rembrandt tulip breaking virus,ReTBV）。Nib基因序列和3′UTR序列分析也表明G、X、ML61、1229、J、HZ这6个分离物之间亲缘关系较近,属于LMoV,而TM与它们的亲缘关系很远,属于TBV。LMoV分离物存在着两个群体,G和X分别处在第1群体和第2群体中,不表现地域相关性及寄主相关性。根据研究结果,将迄今世界各地侵染百合与郁金香的Potyvirus分离物归为LMoV、TBV和ReTBV 3个种。     

番茄花叶病毒外壳蛋白基因及3′端非编码区的克隆、序列分析及其表达

根据已报道的番茄花叶病毒Ｌ株系（ＴｏＭＶＬ）序列人工合成引物,经ＲＴＰＣＲ扩增并克隆了我国番茄花叶病毒分离物（ＴｏＭＶＳ１）的外壳蛋白ＣＰ基因及３′端非编码区。序列测定结果表明,所得ｃＤＮＡ共长６８２个核苷酸,其中ＣＰ基因含４８０个核苷酸,编码１５８个氨基酸,３′端非编码区含２０２个核苷酸,其核苷酸序列与ＴｏＭＶＬ株系具有９９．５％的同源率。将该基因片段克隆到ｐＧＥＭＥＸ１载体中,转入Ｅ．ｃｏｌｉ后诱导表达,经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测证明,该基因已在大肠杆菌中正确表达。这是我国首次报道ＴｏＭＶＣＰ基因序列。     

水稻条纹病毒中国分离物和日本分离物RNA2节段序列比较

测定了来源于我国水稻条纹叶枯病常年流行区的云南楚雄(CX)及病害暴发区的江苏洪泽(HZ)的水稻条纹病毒(RSV)2个分离物RNA2全长序列,其长度分别为3506bp和3514bp。与已报道的日本T和O分离物RNA2序列进行比较的结果表明,这4个分离物可分为两组,其中,HZ、T和O分离物为一组,组内分离物之间,RNA2的毒义链(vRNA2)及RNA2的毒义互补链(vcRNA2)上的ORF的核苷酸一致性分别为97．2％～98．0％和96．8％～97．1％,5′端和3′端非编码区的序列则完全一致。但：HZ分离物与T分离物的亲缘关系更为密切,其基因间隔区(IR)与T和O分离物的等长。另一组为我国CX分离物,组与组之间,vRNA2及vcRNA2上的ORF的核苷酸一致性分别为95．0％～95．7％和93．9％～94．4％。CX分离物的IR与HZ分离物相比缺失了一段8nt的片段。5′端非编码区的序列完全一致,但3′末端非编码区有一个碱基的差异。这些结果表明,RSV在自然界的分子变异与其地理分布具有密切的关系。此外,非编码区序列的高度保守性暗示着它们在病毒基因转录和复制的调控方面具有重要的功能。本文还讨论了RSV的分子流行病学。     

甘蔗花叶病毒3‘末端基因的克隆及外壳蛋白序列分析比较

选取我国SCMV优势株系A株系的分离物SCMV－CA为材料,经过病毒和病毒RNA的提纯,反转录获得病毒cDNA,并克隆到载体pUC19的SmaⅠ位点上,筛选得到多个重组质粒,选取其中一个克隆SCMV－CA54进行测序,得到一个全长为1296bp的苷酸序列,这段序列由一个长为1044bp的开放阅读框架（ORF）和一个长279bp的3‘末端非编码区序列（3‘-UTR)及poly（A）尾巴组成。这个ORF包括病毒完整的外壳蛋白（CP）及部分核内含体蛋白（b(NIb）基因序列,将所得序列同已知SCMV亚组中各株系分离物的核苷酸和氨基酸进行同源性比较,结果表明该序列与其它株系分离的CP核苷酸序列的同源性介于63.7％－77.6％之间,氨基酸的同源性介于64％－89％之间。根据马玲薯Y病毒属的序列同源性划分标准,SCMV－CA与其它株系或分离物的同源性关系均介于种与株系进分标准之间,这是我国首次报道SCMV CP基因序列。     

鸡二价金属转运蛋白1 cDNA的克隆与序列分析

鸡二价金属转运蛋白1（divalent metal transporter 1, DMT1）在动物胃肠道锰吸收过程中起重要作用.根据哺乳动物Dmt1同源蛋白氨基酸序列的保守性设计引物,应用3′RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术,扩增并克隆获得鸡小肠Dmt1 cDNA 3′端1 289bp和1 092bp的2种片段,发现其3′端翻译区和非翻译区存在差异. 根据鸡Dmt1 cDNA 3′端片段的测序结果设计引物,扩增获得1个与3′端片段部分重叠的鸡Dmt1 cDNA 5′端907 bp片段,并对其进行了克隆测序. 根据鸡小肠Dmt1 3′RACE片段和5′RACE片段序列信息进行拼接,从而获得鸡小肠Dmt1 cDNA全序列信息.结果表明,鸡小肠Dmt1 cDNA有2种形式,1种全长为1 972个核苷酸,其中5′非翻译区为104个核苷酸,编码区1 695个核苷酸,3′非翻译区为173个核苷酸,编码1个含564个氨基酸残基的蛋白质;另1种形式为1 775个核苷酸,其中5′非翻译区为104个核苷酸,编码区1 593个核苷酸,3′非翻译区为78个核苷酸,编码1个含530个氨基酸残基的蛋白质.据鸡Dmt1 cDNA推测出的2种形式蛋白质的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠的Dmt1蛋白具有高度同源性,它们的同源性分别为82%、82%、80%,和 84%、84%、83%. 对推测氨基酸序列进行疏水性和跨膜区分析表明,Dmt1蛋白为1种跨膜整合蛋白,具有膜转运蛋白糖基化位点和底物结合位点的保守序列.     

侵染新疆甜瓜的黄瓜花叶病毒衣壳蛋白的克隆及其序列分析

利用同源克隆的方法,扩增获得了新疆16个地区CMV病毒分离物CP蛋白基因全长序列,16个地区CMV病毒分离物CP蛋白基因全长约1 100 bp,最大开放阅读框介于630~690 bp,编码约210个氨基酸,蛋白质大小约25 k D。序列比对发现16个地区CMV病毒核酸序列的3'末端非编码区保守性较低,编码区及其5'端序列保守性较高,氨基酸序列的两端均存在不同数量的变异位点,根据CMV病毒同源性比对结果,16个地区病毒均属于同一CMV亚组。通过核酸序列构建的分子进化树分析发现,本研究分离获得的新疆16个地区CMV病毒衣壳蛋白基因序列则存在较高同源性且不同地区病毒分离物间相对遗传距离差异较小,16个地区与国内外15个地区病毒分离物相比均存在较大差异,统计分析显示,新疆CMV分离物组内核酸序列相对遗传距离差异不显著,相比参考序列,其差异则极显著,这一结果与聚类分析结果能够得到相互印证。分析认为,不同地区CMV病毒CP蛋白基因虽然与外来地区病毒基因存在较大差异,但由于本研究分离的新疆16个地区CMV病毒衣壳蛋白基因序列存在较高同源性且病毒因受不同理化条件的影响往往存在不同程度的变异率,因此认为,分离获得的新疆16个地区CMV病毒可能受地理位置、气候等因素的影响,其基因组中存在异于其他地区不同程度的变异趋势与类型,导致相应蛋白质稳定性也随之发生变化,从而更好的适应在新疆甜瓜植株上的侵染和定殖。     

水稻条叶枯病毒(RStV)基因组组分4的克隆与序列分析

利用RTPCR技术合成并扩增了水稻条叶枯病毒(RStV)中国云南分离物基因组组分4的全长cDNA,将PCR产物克隆在载体pCRII上,并进行全序列测定,所得核苷酸序列及推测的氨基酸序列与日本分离物T进行比较。结果表明,在核苷酸水平,两分离物的vORF、vcORF及基因间非编码区序列的同源性分别为94.9%、94.1%、86.1%,5’端非编码区序列相同,而3’非编码区同源性为96.1%,仅有两个核苷酸不同;在氨基酸水平,vORF及vcORF编码蛋白的同源性分别为99.4%和98.3%。可见,编码区的大小及其氨基酸序列和两末端序列都是很保守的。因此,中国云南分离物Y与日本分离物T可能有很近的亲缘关系。     

由高粱花叶病毒和甘蔗花叶病毒引发的浙江甘蔗花叶病害

从浙江省5个地区采集表现花叶症状的甘蔗病叶,用马铃薯Y病毒科简并引物做PCR扩增及测序鉴定.序列分析表明,5个甘蔗样品均含有高粱花叶病毒(SrMV),其中3个样品中还存在甘蔗花叶病毒(SCMV)的复合侵染.序列比较和系统进化树分析表明,浙江甘蔗样品中的SrMV序列彼此很相似,核苷酸同源性大于93%,与已报道的4个美国分离物在CP区域同源性很高,但是3′非编码区的同源性却仅为70%左右.SCMV欧洲和中国玉米分离物及美国、南非和澳大利亚甘蔗分离物分别形成两个远缘群体,浙江甘蔗分离物群体位于两者之间;群体间CP氨基酸序列同源性均大于80%.甘蔗和玉米上的SCMV差异明显,多为无义突变.     

中国大豆花叶病毒SC7外壳蛋白基因的序列测定及其与美国株系的比较北大核心CSCD

为了探索大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）SC7外壳蛋白（Coat protein,CP）基因序列与病毒致病性作用及其与美国株系的对应关系,本研究通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）,克隆了我国SMV SC7株系的CP基因,并测定了其全序列。结果表明：CP基因长度为795bp,编码的CP蛋白为265个氨基酸。在致病性反应上,SC7的毒力比美国的毒株更强些。在分子水平上,CP基因核苷酸序列差异为4%~5%,编码的氨基酸序列差异为1%~2%。美国株系N端都存在与蚜传有关的保守基序DAG（Asp-Ala-Gl）,但在SC7为DAD（Asp-AlaAsp）。将序列信息与SMV株系在鉴别寄主上的症状反应进行综合分析发现,CP基因的同源性与SMV在鉴别寄主上的致病性反应没有明显关系。     

烟草花叶病毒蚕豆株系基因组全序列 分析及结构特征*1)

根据已报道的TMV-U1株系核苷酸序列合成引物,利用RT-PCR技术获得了覆盖整个烟草花叶病毒蚕豆株系（TMV-B）基因组的cDNA重组克隆.结合末端测序技术,完成了TMV-B全基因组序列测定.TMV-B全基因组共有6 395个核苷酸组成,包括4个开读框（ORF）,分别编码126 ku（含1 116个氨基酸）、183 ku（含1 616个氨基酸）、30 ku（含268个氨基酸）和17.5 ku蛋白（含159个氨基酸）.TMV-B与TMV-U1相比全基因组同源率达99.4%,两病毒基因组5′,3′非编码区和CP基因完全相同.TMV-B与TMV-U1之间在126 ku蛋白中有6个氨基酸差异,54 ku蛋白中有2个差异,30 ku蛋白中有3个差异.对导致TMV-B侵染蚕豆的可能致病机理进行了分析.     

我国大蒜潜隐病毒的基因组结构及3′端序列的变异

从我国6个省市12个大蒜样品上共检出10个不同的香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)分离物, 测定了浙江分离物ZJ1的基因组全序列和其他9个分离物的基因组3′端序列. ZJ1分离物RNA基因组全长8363个核苷酸, 3′端具polyA尾, 含6个可读 框(ORF), 分别编码复制酶, TGB1, TGB2, TGB3, CP和NABP, 基因组结构和其他Carlavirus属成员相似. 序列分析表明, 10个分离物均为大蒜潜隐病毒(GarLV), 不同分离物TGB2, TGB3和NABP的差异大于CP的差异, 且这些分离物和葱潜隐病毒(ShLV)也具有很高的同源性. 系统进化树分析表明, 大蒜来源的GarLV分离物可以分成4个类群, 我国分离物分别属于4个不同类群.     

莴苣花叶病毒浙江余杭分离物基因组全序列及其结构分析

测定了莴苣花叶病毒(LMV)浙江余杭分离物基因组全序列.此病毒分离物基因组由10*!080个核苷酸组成,具典型的马铃薯Y病毒科成员基因组结构,与已报道的欧洲、美国和巴西LMV核苷酸同源性为96.7%～98.8%,氨基酸同源性97.8%～99.0%.根据外壳蛋白氨基酸序列和5′端非编码区核苷酸序列分析比较及分子进化树分析,可将全球LMV分为西欧-加利福尼亚、希腊和也门3个类群.LMV有可能起源于加利福尼亚州向西欧,进而向希腊和也门扩展,浙江余杭LMV有可能来源于加利福尼亚州和西欧.     

我国禽脑脊髓炎病毒分离株全基因组的测定

测定了我国禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)分离株L2Z株的全基因组核苷酸序列.该病毒株的3′和5′非编码区核苷酸序列用3′和5′RACE(cDNA末端快速扩增)法获得.基因组全长为7 059个核苷酸残基,包括494个核苷酸残基的5′非编码区、6 402个核苷酸残基的开放阅读框和136个核苷酸残基的3′非编码区及poly(A)尾巴.与已发表的AEV疫苗株1 143的基因组序列比较发现,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为98%和97.6%.结构蛋白(VP1～VP4)中,主要宿主保护性免疫原蛋白VP1氨基酸之间差异较小.与小RNA病毒科其它病毒属相比,在非结构蛋白3D中,预测的8个RNA依赖性RNA聚合酶主要结构域中的4个高度保守.从而进一步确认了AEV的分子特性.     

侵染广西罗汉果的小西葫芦黄花叶病毒的鉴定及抗血清制备

在广西临桂罗汉果花叶畸形病株上获得了一个线状病毒分离物LGL-1,寄主范围、蚜传能力测定、病毒粒子形态和细胞病理特征研究表明,它是马铃薯Y病毒科成员.采用马铃薯Y病毒科特异性简并引物做PCR扩增,并测定了分离物LGL-1的基因组3′-末端序列,序列分析表明它是小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）.系统进化树分析揭示,世界范围内的ZYMV分离物主要可分为3大群体,分离物LGL-1为中国特有群体Group Ⅲ成员.原核表达制备了分离物LGL-1的外壳蛋白抗血清,明确了ZYMV是引起广西罗汉果病害的主要病毒,并且比较了原核表达法和提纯病毒法制备的抗血清,在病样的间接ELISA法检测中结果的差异.