禽脑脊髓炎病毒VP0基因的克隆与序列测定

禽脑脊髓炎（avian encephalomyelitis,AE）又名流行性震颤,是一种主要侵害1月龄内雏鸡的病毒性传染病。该病传染迅速,既可垂直传播又可水平传播,危害极大。世界许多国家和地区均有该病发生和流行的报道。我国学者张泽纪等于1980年首次发现广东有疑似此病,1982年李心平等通过病理学方法确认此病,随后在我国各地均发现该病的发生和流行,给养鸡业造成较大的损失。 　　禽脑脊髓炎病毒（AEV）是一种无囊膜的二十面体对称的病毒粒子,大小为26nm左右。Shafren和Tannock（1991）利用放射性碘标记电泳分析AEV的结构蛋白发现,它主要有3种结构蛋白即VP1、VP2和VP3。Marvil等（1999）测定了AEV疫苗株1?143株的全基因组序列,揭示出AEV结构蛋白有VP1、VP2、VP3和VP4,其中VP2和VP4又合称VP0。我们从河北地区某艾维因肉鸡群自然发病的肉雏鸡脑组织中分离鉴定出一株AE病毒-L2Z株。根据发表的AEV序列设计引物,利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术,在体外从AEV分离株感染的SPF鸡胚病变组织中扩增出VP0基因,在该片段的5′和3′端均加上KpnI位点,成功地将VP0 cDNA插入到质粒pBssK的KpnI位点之间,获得阳性克隆,并对其进行测序。结果发现,该基因长726bp,编码242个氨基酸,与AEV 1?143株VP0基因的核苷酸与氨基酸之间的同源性分别为95.2%和97.5%,而与小RNA病毒科其它病毒属如人甲肝病毒HAS-15株相应基因核苷酸和氨基酸之间的同源性分别为50.1%和50.8%,与肠道病毒属的PV-1 Sabin株的同源性分别为20.5%和16.5%,与鼻病毒属的HRV-14株的同源性分别为25.5%和17.8%,与心病毒属的EMCV PV2株的同源性分别为25.9%和19.4%,与口蹄疫病毒属FMDV-C株的同源性分别为26.3%和18.6%,与人类肠道致细胞病变孤儿病毒ECHOV的同源性分别为24.9%和16.1%。在系统发育树上,L2Z株与AEV 1?143株之间的距离最近,其次与甲肝病毒之间距离较近,而与小RNA病毒科其它病毒属之间的距离较远。 　　Marvil等（1999）首先测定出AEV 1143株的全基因序列,发现与甲肝病毒HM-175株之间氨基酸同源性为39%,与该科病毒其它病毒属之间的氨基酸同源性为19%～21%,其中VP0基因与甲肝病毒HM-175株相应基因氨基酸之间同源性达到71.8%,认为AEV与甲肝病毒属之间关系密切。Todd等（1999）对AEV VR株的3′端869bp序列测定表明,它与甲肝病毒相应区域氨基酸之间的同源性为35.7%,均高于与该科病毒其它病毒属相应氨基酸之间的同源性,也认为AEV与甲肝病毒之间最为接近。本试验发现：AEV分离株L2Z株VP0基因与甲肝病毒相应氨基酸之间的同源性为50.8%,而与该科病毒的其它属病毒相应氨基酸之间同源性仅在16.1%～21.9%之间。从系统发育树上也进一步表明,AEV L2Z株与甲肝病毒之间同源性之间距离最短,亲缘关系最近,而与肠道病毒属之间亲缘关系较远。第6次国际病毒学分类报告中将AEV划为小RNA病毒科肠道病毒属,但从我们的实验结果与Marvil等（1999）和Todd等（1999）的报道,从基因水平上证明AEV与甲肝病毒属更接近,而与肠道病毒属亲缘关系较远,因此认为AEV是否归为小RNA病毒科肠道毒属有待进一步确定。 　　本研究成功地进行了AEV分离株VP0基因的克隆与序列测定,为下一步进行AEV基因结构研究打下了基础。     

重庆动物园亚洲象真菌性皮肤病的治疗探讨

重庆动物园亚洲象普遍发生一种皮肤病,表现为臀部、腰部或脖颈部等处皮肤不同程度的白斑、脱屑、皲裂、瘙痒和结痂等,严重妨碍动物生长发育,在应用特比萘芬等化学药物治疗效果不佳的情况下,于2008年经分离鉴定推测为小孢子菌真菌性皮肤病,自2009～2011年采用艾叶水剂外洗治疗,并以艾叶混合饲料饲喂动物,配合艾叶环境熏蒸消毒,取得良好的防治效果。初步表明艾叶为一种具有推广前景的防治动物皮肤病的中草药。     

我国禽脑脊髓炎病毒分离株全基因组的测定

测定了我国禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)分离株L2Z株的全基因组核苷酸序列.该病毒株的3′和5′非编码区核苷酸序列用3′和5′RACE(cDNA末端快速扩增)法获得.基因组全长为7 059个核苷酸残基,包括494个核苷酸残基的5′非编码区、6 402个核苷酸残基的开放阅读框和136个核苷酸残基的3′非编码区及poly(A)尾巴.与已发表的AEV疫苗株1 143的基因组序列比较发现,它们之间核苷酸和氨基酸的同源性分别为98%和97.6%.结构蛋白(VP1～VP4)中,主要宿主保护性免疫原蛋白VP1氨基酸之间差异较小.与小RNA病毒科其它病毒属相比,在非结构蛋白3D中,预测的8个RNA依赖性RNA聚合酶主要结构域中的4个高度保守.从而进一步确认了AEV的分子特性.     

鸳鸯茉莉花色变化过程中的生理生化特性研究

以3年生鸳鸯茉莉(Brunfelsia acuminata Benth.)5个不同花期(花蕾期、初开期、全开期、过渡期、末花期)的花瓣为试材,研究其开花过程中花瓣的色度值、类黄酮、类胡萝卜素、花色苷含量、细胞p H值以及相关酶活性的变化,并分析各指标之间的相关性。结果显示,除全开期外,其它4个时期各色度值变化不明显,初开期、全开期和过渡期,明亮参数L值逐渐增大,红绿参数a值、黄蓝参数b值和彩度C值急剧降低;类黄酮含量在过渡期最低,其它阶段无显著差异;类胡萝卜素含量变化呈上升-下降-稳定的趋势,全开期达到最高;花色苷含量则随开花进程不断下降,花蕾期最高;花蕾期、初开期、全开期的SOD活性变化不显著,过渡期时显著升高,末花期又迅速回落到最低值;POD活性不断上升,末花期为花蕾期的28.73倍;CAT活性前期变化不显著,末花期时有一定幅度的升高;花瓣色度各指标、花色苷含量、上述酶的活性、p H值等几个参数间均存在极显著相关性,但SOD活性、类胡萝卜素、类黄酮与所有参数的相关性均不显著。研究结果表明花色苷是影响鸳鸯茉莉花色变化的决定性代谢产物,POD和CAT活性是调节花色苷降解速率的主要抗氧化酶。     

金黄色葡萄球菌反向线性杂交探针检测方法的建立

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌的简单、快速、灵敏、准确的方法。方法根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶nuc基因,设计一对通用引物及两条特异性探针,用生物素标记通用引物的5＇端,将两条特异性探针固定于硝酸纤维膜上,使PCR产物与探针杂交。结果建立的反向线性杂交探针方法,其检测限为2 ng/μL,检测特异性和准确性均为100%。结论建立的反向线性杂交检测方法具有较高的敏感性和特异性,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测。     

艾叶用于动物实验室空气消毒的效果观察及吸人刺激实验

目的研究艾叶熏蒸动物实验室空气消毒的适宜剂量及其对实验动物的吸人刺激性。方法（1）用艾叶1g／m^3、2g／m^3、4g／m^3的低、中、高三个剂量分别对三间空动物实验室空气熏蒸消毒,检测消毒前及消毒后12h空气菌落数（CFU）,每周1次,连续10周。以CFU≤30个／皿为合格标准,计算各组消毒10次后的合格率。（2）将40只SD大鼠分为对照组和艾叶低、中、高剂量组,每组10只,放在4个隔离器内。分别用艾叶1g／m^3、2g／m^3、4g／m^3的剂量对低、中、高剂量组隔离器进行熏蒸消毒,12h后取各组大鼠肺组织,光镜下观察其损伤情况。结果（1）消毒前,低、中、高剂量组CFU均不合格,且组间差异无显著性;消毒后12h,各组CFU均合格,低剂量组与中、高剂量组差异显著（P＜0．05）,中、高剂量组组间差异不显著;消毒10次,低剂量组合格率为80％,中、高剂量组合格率均为100％。（2）与对照组比较,艾叶三个剂量组大鼠肺组织均出现不同程度的病理变化。结论（1）艾叶用于动物实验室空气消毒的较佳剂量为2g／m^3。（2）艾叶熏蒸空气消毒对实验动物呼吸系统有刺激性损伤。     

反向斑点杂交检测泰泽病原体

目的建立一种简洁稳定、特异灵敏的检测泰泽病原体(Tyzzer’s organism)的反向斑点杂交方法(reverse dot blot,RDB)。方法根据泰泽病原体16S rDNA保守基因组序列设计引物和特异性探针,上游引物用生物素标记,进行PCR扩增,建立反向斑点杂交方法,用此法进行了特异性和灵敏度实验,同时,用RDB、ELISA和IFA对41只小鼠、38只大鼠进行了检测。结果 RDB特异性强,最低检测限为4.5 ng/μL。对79例实验动物的检测中,与ELISA检测结果一致性为100%,阳性率是7.59%(6/79);与IFA一致性为92.4%(73/79),IFA阳性率是0%。结论建立了PCR扩增与分子杂交相结合的准确、灵敏、特异的泰泽病原体反向斑点杂交检测方法。     

柏木根系分泌物对栾树细根形态及N、P含量的影响

为研究混交过程中柏木根系分泌物对栾树细根生长的影响,以一年生栾树盆栽幼苗为研究对象,通过施加1株、2株、4株、8株4个浓度柏木根系分泌物(分别记为G1、G2、G4、G8)于栾树盆栽中,探讨柏木根系分泌物对栾树幼苗1～5级细根形态及N、P含量的影响。结果表明:(1)栾树细根直径随根序的增加而增大,施加根系分泌物显著减小了1～2级细根的直径(P0.05);细根比根长、比表面积均随根序的增加而减小,施加根系分泌物显著增大了1～2级细根的比根长及比表面积(P0.05);随根系分泌物施加浓度的提高,栾树比根长及比表面积先增大,而直径先减小,然后均趋于平缓波动的态势。(2)栾树细根N、P含量均随根序的增加而减小,而N/P在根序间的变化不显著;施加柏木根系分泌物显著增大了栾树1～2级细根的N、P含量(P0.05),但减小了1～5级细根的N/P;随根系分泌物施加浓度的提高,栾树细根P含量增大,N/P减小,而N含量先增加后呈现平缓变化的趋势。(3)栾树细根N、P含量均与其比根长、比表面积和直径等形态特征之间呈显著的相关关系(P0.05)。研究发现,柏木根系分泌物可改善土壤养分的有效性,从而缓解栾树植株的缺P症状,细根通过调整其形态以提高养分利用效率;柏木根系分泌物主要影响栾树1～2级细根的形态及N、P含量;4株柏木根系分泌物的剂量更有利于栾树根系的生长。     

反向线性探针杂交在检测实验动物沙门菌中的研究

目的建立简便、快速、准确、灵敏、特异的沙门菌检测方法。方法根据沙门菌argT基因序列设计通用引物和3'、5'均加有polyC的特异性探针。上游引物5'标记生物素,将探针线性固定在硝酸纤维素膜上,使沙门菌PCR扩增产物与探针进行杂交,通过优化杂交条件,建立反向线性探针杂交检测方法。利用该方法对重庆地区74只实验动物进行检测,同时与传统分离培养方法比较。结果反向线性探针杂交方法灵敏度高,对沙门菌PCR扩增产物在3ng/μL以上可有效检测。从细菌分离培养及DNA提取到PCR扩增及反向杂交结束仅需27h。该检测方法特异性高,对6种非沙门菌的检测中,其特异性为100%。应用传统分离培养方法和反向线性探针杂交方法分别检测42只KM小鼠和32只SD大鼠,两种方法检测结果一致性为100%。结论反向线性探针杂交检测方法,具有快速、可靠、敏感和特异的特点,可用于沙门菌感染时的检测,适合应用于实验动物沙门菌的监测。     

花生类受体蛋白激酶基因AhBAK1的克隆及原核表达

BAK1是富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶,参与调控植物先天免疫反应过程中的程序性细胞死亡过程。实验室已有的花生铝胁迫转录组数据揭示AhBAK1为铝胁迫响应基因。为研究其在花生抗铝机制中的作用,该文分析了铝胁迫下AhBAK1在花生耐铝品种‘99-1507’和铝敏感品种‘中花2号’(‘ZH2’)根尖中的转录变化,采用RT-PCR技术进行扩增AhBAK1的完整CDS序列,并对序列特征进行了分析。结果表明:AhBAK1显著响应铝处理,且在‘99-1507’中有着更强的诱导表达; AhBAK1包括625个氨基酸残基,属富亮氨酸重复区类受体激酶,具跨膜域和蛋白激酶催化结构域,不存在信号肽,预测定位于细胞质膜;我们进一步构建了含有AhBAK1激酶域的pGEX-6p-1-AhBAK1-CD重组质粒,体外诱导表达出约70kD可溶性蛋白,经凝胶亲和层析纯化,最终得到基于蛋白印迹实验(Western Blot)验证正确的重组蛋白。为进一步研究AhBAK1的生物学功能和生化功能奠定了基础。