汉坦病毒陈株S基因编码区的克隆、序列分析及表达

从汉坦病毒陈株感染的Vero-E6细胞裂解液中提取病毒RNA,经逆转录PCR获得病毒S基因编码区约1.3kb cDNA片段,克隆该片段后进行核苷酸序列测定,并与汉坦病毒76-118株进行同源性比较,结果二者核苷酸序列同源性为86%,推导的氨基酸序列同源性为97%.将该基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌中获得高效表达.表达产物为GST-NP融合蛋白.SDS-PAGE检测表达蛋白分子约72kD左右.Western blotting和ELISA试验结果表明,表达产物可与多株抗汉坦病毒核蛋白的McAb发生反应,其抗原表位及McAb反应谱与76-118株相比存在某些差异.     

家蚕核型多角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

采用PCR方法克隆了家蚕核型多角体病毒中国镇江株 (BmNPV ZJstrain)的酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因(ptp) ,测定了该基因的核苷酸序列 ,比较了与相关病毒相应基因的同源性 ,并将该基因插入到原核表达质粒在大肠杆菌中进行了表达。该基因的编码部分由 5 0 7个核苷酸组成 ,编码 16 8个氨基酸残基的蛋白多肽 ,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酶酯催化部位的“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV) ptp 基因和BmN PV -T3 株 (日本 )拟为的 ptp基因核苷酸序列的同源性分别为 96 8%和 98 2 % ,蛋白质氨基酸序列的同源性分别为 97 0 %和 97 6 %。将该基因插入到温度诱导型表达质粒pBV2 2 1的温控启动子PRPL 之后 ,在大肠杆菌JM10 9中表达了具有催化活性的蛋白质 ,分子量约为 19kD ,表达产物能催化对硝基酚磷酸钠 (PNPP)的脱磷酸反应 ,这种催化作用可被钒酸钠和ZnCl2 抑制     

一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2—4—3基因

分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV)上海株SH95的病毒核酸dsRNA ,应用随机引物将RNA反转录成cDNA ,以此为模板一步扩增出A片段前体融合蛋白基因即VP2 4 3基因 ,将其克隆入 pGEM T载体 ,并进行序列分析 ,其与超强毒株HK4 6的核苷酸序列的同源性达 98% ,整个基因有 5个氨基酸差异 ,同源性达99.5 1% (10 0 7/ 10 12 )。     

SARS病毒S和N蛋白抗原表位的基因合成、融合表达及纯化鉴定

通过计算机分析SARS病毒N蛋白和S蛋白的氨基酸序列 ,初步确定含强抗原表位的N蛋白片段和S蛋白片段 ,共 5 6 0个氨基酸。选择真核和原核生物均偏爱的密码子 ,化学合成全新的SARS病毒N蛋白片段和S蛋白片段的基因序列 ,利用基因工程技术将两个基因片段串联 ,克隆至质粒Pet2 8a(+)内的NcoⅠ/EcoRⅠ位点 ,表达S蛋白片段和N蛋白片段的融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) ,筛选获得了高效表达SARS病毒S蛋白片段和N蛋白片段融合蛋白的工程菌 ,表达的SARS病毒的融合蛋白约占菌体蛋白总量的 30 %左右 ,部分以可溶性形式存在。经离子交换柱和反相高压液相纯化获得了表达的融合蛋白 ,经初步鉴定 ,显示该融合蛋白有较好的抗原性和特异性.     

幽门螺杆菌flaA基因表达载体的构建和产物免疫性的鉴定

采用高保真PCR从幽门螺杆菌Y0 6株DNA中扩增全长flaA基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列 ,构建 pET32a的flaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达 ,采用Hp全菌抗体的westernblot和兔抗融合蛋白血清的免疫扩散试验鉴定其免疫性。所克隆的flaA基因核苷酸和氨基酸序列与文献报道的同源性分别为 96 .2 8%～ 97.13%和 99.4 1%～ 10 0 %。pET32a flaA BL2 1DE3系统表达的FlaA融合蛋白量高达细菌总蛋白的 4 0 %～ 5 0 %。FlaA融合蛋白能与Hp全菌抗体及家兔免疫血清发生结合反应。     

甜菜坏死黄脉病毒RNA4 cDNA克隆、序列分析及其编码蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒(Beet Necrotic Yellow Vein Virus,简称BNYVV)内蒙分离物(NM)RNA为模板,通过反转录和PCR扩增得到了BNYVV RNA4基因组的cDNA克隆pGBF6。序列分析结果表明,pGBF6含有全长RNA4 cDNA插入片段,大小为1465个核苷酸,含有一个849个核苷酸的开放阅读框架,编码产生由282个氨基酸组成的分子量为31kDa的蛋白。与法国F2分离物RNA4相比,其核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列同源性分别为97.1％和96.4％,并在5'端非编码区比F2分离物缺失了3个核苷酸。将RNA4编码区cDNA克隆到原核表达载体pFLAG·MAC上,获得融合蛋白表达质粒pFMBF87。所构建的融合蛋白由载体序列编码的14个氨基酸和31kDa蛋白C端的233个氨基酸组成。经IPTG诱导,Westem blotting分析表明,该融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达。本文还对内蒙分离物的株系划分进行了讨论。     

从云南烟草上检测到的黄瓜花叶病毒亚组II分离物

在对云南省烟草病毒病的研究中,分离到一种直径约26～30nm的球形病毒。提纯病毒进行的SDSPAGE发现一条55kD蛋白带。55kD蛋白N端10个氨基酸与CMV亚组II的Q株系外壳蛋白N端氨基酸同源性为100%。以CMVQ抗血清对55kD蛋白进行了Western blot检测,发现55kD蛋白与CMV Q株系抗血清有血清学反应。根据已报道的CMV亚组II外壳蛋白基因序列合成引物,采用RTPCR技术扩增到一条约09kb的cDNA条带,并进行了克隆及序列测定,经Genbank比较,发现此09kb cDNA包含一657bp的外壳蛋白基因,其核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与CMV亚组II分离物有极高的同源性,分别达97%～98%和96%～99%,而与亚组I分离物的同源性仅为75%～76%和78%～79%。因此,该球形病毒应为CMV亚组II的一个分离物,命名为CMVYnb。     

一步法扩增克隆IBDV上海超强毒VP2-4-3基因

分离、纯化了鸡传染性法氏囊病病毒超强毒 (vvIBDV) 上海株SH95的病毒核酸dsRNA,应用随机引物将RNA反转录成cDNA,以此为模板一步扩增出A片段前体融合蛋白基因即VP2-4-3基因,将其克隆入pGEM-T载体,并进行序列分析,其与超强毒株HK46的核苷酸序列的同源性达98%,整个基因有5个氨基酸差异,同源性达99.51%(1007/1012).     

甘薯贮藏蛋白(sporam in)A基因编码区克隆及序列同源性分析

采用 PCR技术 ,从我国广泛栽培甘薯品种南薯 88基因组中扩增和克隆到甘薯贮藏蛋白 A基因编码区段 ,并测定了其全部核苷酸序列 .该编码区长 65 7bp,编码一个长 2 1 9个氨基酸残基的蛋白质 ,其中信号肽长 37个氨基酸残基 ,成熟蛋白质长 1 82个氨基酸残基 ,其分子量为 2 0 k D.将该片段的核苷酸序列与已登录在 Gen Bank中的另外 6个甘薯贮藏蛋白 A基因编码区序列进行比较 ,发现其同源性高达 90 % ,说明甘薯贮藏蛋白 A基因编码区序列具有高度保守性 .虽然 7个基因编码区的核苷酸总变异为 1 0 % ,但在每两个基因之间的比较则表明其核苷酸的变异范围小于 7% .     

鸡传染性支气管炎病毒变异株（793／B）核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank已经发表的传染性支气管炎病毒(IBV)N全基因组序列设计引物,对IBV793/B分离毒株N基因进行克隆与序列分析。结果表明,IBV793/B的N基因由1229bp组成,与GenBank已发表的11株IBV的N基因相比较,IBV793/B的N基因共有88处点突变,在第991位发生了一个核苷酸的缺失。N基因的核苷酸同源性为86.9%～91.4%,氨基酸同源性为75.8%～77.5%。表明IBV93/B的N基因存在着较大的变异性。     

内蒙古白绒山羊IGF-IR基因cDNA克隆及组织表达特异性分析

旨在克隆内蒙古白绒山羊IGF-IR基因并分析其基本表达模式.采用RT-PCR克隆基因,将得到的IGF-IR基因cDNA片段的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析.半定量RT-PCR进行组织特异性表达检测.获得了内蒙古白绒山羊IGF-IR基因3’端编码区2118 bp的cDNA序列(JN200823),编码705个氨基酸残基.核苷酸序列与牛的IGF-IR( XM606794.3)基因同源性为98％,相应的氨基酸序列同源性为99％.SMART分析表明,推导出的编码蛋白具有跨膜域,酪氨酸激酶催化域.半定量RT-PCR检测表明,IGF-IR基因在绒山羊脑、胰腺、肝、肾组织中均有表达.     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF1基因克隆及在E.coli中的表达

猪圆环病毒(porcinecircovirus ,PCV)属圆环病毒科(Circoviridae) ,为单股负链DNA病毒,以滚环方式进行复制,是目前已知的最小的动物病毒之一.PCV有2种基因型即PCV 1和PCV 2 ,两者细胞培养均不引起病变.前者广泛存在于猪源肾细胞中,但并不引起感染猪发病,其基因组为1 75 9bp ;后者首先由Allan等[1 ] 从患断奶猪多系统衰弱综合症(postweaningmultisystemicwastingsyndrome ,PMWS)的猪群中分离到,被证明为PMWS的重要病原.PCV 2主要侵害感染猪的免疫系统[2 ] ,从而诱发猪体的免疫抑制.PCV 2常和呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)…     

伪狂犬病病毒糖蛋白G基因的结构分析及其原核表达

利用PCR技术扩增了伪狂犬病毒湖北株 (PRVHB)糖蛋白G(gG)基因 ,进行了序列测定和分析。结果显示扩增和测序片段长 180 4bp ,G C含量 6 8.78%。gG基因ORF长 15 0 0bp ,编码 5 0 0个氨基酸组成的多肽。与PRVRice株 gG基因比较 ,两者核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为 98%、84.1%。 32 0～ 380位之间的氨基酸序列存在较大差异。根据序列分析结果 ,选取 gG基因长短不同的两个片段分别克隆到原核表达载体 pET2 8a( )进行表达。经SDS PAGE和Dot ELISA分析证实 ,表达出分子量大小分别约为 5 5kD和 6 3kD的特异性gG多肽 ,这为深入阐明PRV gG基因结构与功能及研制 gG ELISA诊断试剂盒奠定了基础     

G蛋白Rab3a cDNA的克隆与表达

利用PCR法 ,从人胎盘总cDNA中扩增得到Rab3acDNA的全编码区 .序列分析表明 ,扩增得到的Rab3acDNA有 5个核苷酸发生了变异 ,但翻译的氨基酸与发表的完全一致 .将扩增得到的Rab3acDNA克隆于原核融合表达载体pGEX 4T 1中 ,在E .coliBL2 1中经IPTG诱导表达 .为了进一步鉴定表达产物 ,对纯化后的Rab3a蛋白进行了SDS PAGE、N端氨基酸测序、质谱分子量测定及氨基酸组成分析鉴定 .结果显示 ,表达蛋白的分子量约 2 5kD ,N端氨基酸序列为MASATDSR ,氨基酸组成分析表明 ,Rab3a蛋白获得了正确表达     

Human ribosomal protein S3a: cloning of the cDNA and primary structure of the protein.

The amino acid (aa) sequence of human ribosomal protein S3a (hRPS3a) was deduced partially from the nucleotide sequence of the corresponding cDNA and confirmed by direct aa sequencing from the N terminus of the purified hRPS3a protein. The cDNA clone was isolated from a cDNA expression library in the pEX vector using antibodies. The hRPS3a protein has 263 aa and its calculated M(r) is 29 813.     

The nucleotide sequence of a cDNA clone containing the entire coding region for mouse X-chromosome-linked phosphoglycerate kinase

A clone containing cDNA for X chromosome-linked phosphoglycerate kinase (PGK-1) was isolated from a mouse myeloma cDNA library. The nucleotide (nt) sequence of the cDNA has been determined, and the amino acid (aa) sequence of the enzyme thereby deduced. At the nt level, the coding region of mouse PGK cDNA has 93% homology with human X-linked cDNA and 60% homology with the yeast gene. Mouse PGK-1 protein contains 416 aa and is 98%, 96% and 64% homologous with human, horse, and yeast enzyme sequences, respectively.     

猪水泡病病毒强致病性毒株主要保护性抗原蛋白基因cDNA的序列测定与分析

从猪水泡病病毒（ＳＶＤＶ）细胞培养物的ＰＥＧ浓缩毒中提取病毒ＲＮＡ,经ＲＴ－ＰＣＲ和套式ＰＣＲ扩增病毒主要保护性抗原蛋白基因,将扩增产物１．６ｋｂ插入ｐＵＣ１８载体中,经亚克隆后用双脱氧链终止法测定其序列,与已发表的ＳＶＤＶ分离物该区序列作比较,核苷酸同源性为９６％－９７％,氨基酸同源性为９８％,参与构成ＳＶＤＶ中和性抗原位点的几个氨基酸残基均很保守;与已发表的柯萨奇Ｂ５病毒的对应序列比较,两者核苷酸序列同源性为７７％,而推导的氨基酸顺序同源性竞高达９２％。本文结果有助于ＳＶＤＶ的分子流行病学研究,并为其和柯萨奇Ｂ５病毒的相互关系提供参考数据,为ＳＶＤＶ新型疫苗研究提供了基础材料