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利用基因工程技术制备抗原性好的弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的融合蛋白,并用作抗原检测弓形虫抗体。根据弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列,通过计算机分析,筛选出其中较强的抗原决定簇。用PCR方法分别扩增含抗原决定簇的基因片段。将这两个基因片段克隆至同一质粒pET28a(+)内,表达一个融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选表达该融合蛋白的工程菌。纯化表达的融合蛋白,用已知的6份抗弓形虫IgM阳性血清和大量正常人血清,ELISA法检测纯化融合蛋白的抗原性和特异性。获得了高效表达含弓形虫GRA6蛋白和P30蛋白抗原表位的工程菌,表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的25%。纯化获得了表达的融合蛋白,该蛋白有较好的抗原性和特异性。表达的弓形虫GRA6和P30融合蛋白可用做抗原检测弓形虫抗体,用于临床及孕妇检测,对优生优育有较大意义。 相似文献
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To establish a rapid, sensitive and specific diagnostic assay for Hantavirus with microarray techniques, specific primers and probes were designed according to the conservative and specific DNA sequence of 76-118 strain and R22 strain. The probes were spotted on glass slides to form microarrays.The Cy3-1abled single stranded DNA fragments prepared by dissymmetical PCR were hybridized with the probes on the glass slides. The microarrays were scanned and analyzed with a scanner. The results showed that the DNA microarray could detect the different typed DNA of HTN and SEO with adequate specificity and sensitivity. The developed DNA microarray and techniques might be a very useful method for diagnosis and prevention, and could be widely applied in specific pathogens detection ofinfectious diseases such as hemorrhagic fever with renal syndrome. 相似文献
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目的 :克隆人IL 1 8基因 ,并构建高表达人IL 1 8的工程菌 ,纯化获得重组人IL 1 8。方法 :从人肿瘤组织内提取总RNA ,利用逆转录聚合酶链反应扩增人IL 1 8基因 ,在基因的 5′和 3′端分别加上NcoI和EcoRI酶切位点 ,酶切后直接克隆至质粒表达载体pET2 8a( + )内 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,挑选转化子 ,IPTG诱导后SDS PAGE筛选高表达人IL 1 8的工程菌。提取表达菌质粒进行DNA序列分析。表达菌大量培养及IPTG诱导后 ,超声破菌收集包涵体 ,十二烷基肌苷酸钠溶解后用阳离子柱和分子筛纯化。结果 :克隆的人IL 1 8基因序列完全正确 ,工程菌表达的人IL 1 8约占菌体蛋白 30 % ,以包涵体形式存在 ,经阳离子柱和分子筛纯化获得了较纯的人IL 1 8。结论 :可用构建的工程菌大量制备人IL 1 8,为开展人IL 1 8药物的临床前研究奠定了基础。 相似文献
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[目的]探索猪链球菌2型感染后单核/巨噬细胞启动信号转导通路机制,探讨荚膜唾液酸对细菌激活巨噬细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路的影响.[方法]以小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞为研究对象,采用RT-PCR、Western blotting、免疫荧光和ELISA法分别检测猪链球菌2型野毒株、唾液酸缺失突变株、唾液酸回复突变株感染后不同时间点巨噬细胞TLR2 mRNA转录水平、AKT磷酸化水平、NF-κB激活程度以及前炎症因子TNF-α分泌水平;再分别用TLR2阻断剂和PI-3K抑制剂预处理巨噬细胞,检测上述分子的表达水平.[结果]唾液酸缺失株可选择性的活化信号转导通路途径.RT-PCR结果表明,缺失株TLR2 mRNA表达水平自1h开始升高,1.5 h达高峰后有所下降;Westernblotting显示,缺失株TLR2蛋白表达水平7h达高峰,9h下降;p-AKT水平1.5-5 h持续稳定在高峰水平,7h后开始下降;免疫荧光可见15 min NF-κB激活-核转运程度较高;ELISA结果显示,10h之后TNF-α的水平显著高于野生株和回复株.使用TLR2阻断剂和PI-3K抑制剂,三菌株通路活化程度均明显受抑制.[结论]荚膜唾液酸可抑制宿主免疫细胞TLR2-AKT-NF-κB信号通路的激活,藉此参与细菌逃避宿主的免疫防御作用. 相似文献
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人白细胞介素29的cDNA克隆和序列分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 :克隆人白细胞介素 2 9的cDNA ,以进一步研究其结构与功能的关系。方法 :分离人的外周血单个核细胞 ,IMDM(含PHA和IL-2 )培养过夜后 ,Poly(I:C)诱导 2 4~ 48h ,收集细胞 ,Trizol法提取细胞总RNA ,RT-PCR扩增出全长 603bp的IL-2 9cDNA ,将其与表达载体pPROEXTMHTa连接 ,转入大肠杆菌BL21(DE3) ,建立了hIL-29的cDNA克隆。结果 :测序表明克隆的cDNA与Genebank报道的人IL-29cDNA序列完全一致。结论在国内成功获得hIL-29的cDNA克隆 。 相似文献
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目的:通过基因克隆和体外转录,获得汉坦病毒汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的RNA全长cRNA,为汉坦病毒病原学检测提供阳性定量标准品。方法:设计汉滩型76118株和汉城型R22株S基因克隆引物,PCR获得相应片段,分别克隆至含双启动子的PCRⅡ载体中,测序鉴定无误后,重组质粒分别经内切酶SpeⅠ、SacⅠ线性化,用T7 RNA聚合酶进行体外转录,产物经DNase处理、纯化后测定浓度,经RT-PCR验证。结果:获得汉滩型76118株及汉城型R22株S基因的cRNA片段,并可准确定量其拷贝数,76118株和R22株的质量浓度分别为80、17.58 ng/μL。结论:获得的cRNA样品可作为汉坦病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。 相似文献
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