G蛋白Rab3a协同神经生长抑制因子(GIF)抑制神经元的生长

为了研究G蛋白Rab3a与神经生长抑制因子 (growthinhibitoryfactor,GIF ,原称金属硫蛋白 3,MT 3)相互作用对神经元细胞生长的影响 ,以嗜铬细胞瘤株 (pheochromocytoma)PC1 2充当神经元模型 .将hMT 3(humanMT 3)和Rab3a基因分别克隆至真核表达载体pFlag CMV 2和pSV HA中 ,质粒共同转染PC1 2细胞 ,观察转染后细胞的生长状态 .以共转染pFlag CMV 2 hMT 1和pSV HA Rab3a的细胞组作为对照 ,验证hMT 3与Rab3a相互作用对PC1 2影响的特异性 .结果发现 ,共转染pFlag CMV 2 hMT 3和pSV HA Rab3a的PC1 2细胞生长明显受到抑制 ,细胞生长抑制率与GIF在脑提取物存在F的神经元生长抑制作用接近 ,但转染两基因中的任何单个基因以及共转染pFlag CMV 2 hMT 1和pSV HA Rab3a对PC1 2细胞生长无影响 .进一步构建重组表达质粒pGEX 4T 1 Rab3a和pGEX 4T 1 hMT 3,转化大肠杆菌BL2 1 ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析、凝血酶酶切和SephacrylS 1 0 0纯化 ,得到纯度 95 %以上的Rab3a和hMT 3蛋白 .体外细胞生物学活性检测表明 ,表达的Rab3a蛋白与重组hMT 3蛋白共培养PC1 2 ,对细胞的生长产生了明显的特异性协同抑制作用 ,抑制曲线与GIF在脑提取物存在下的神经元生长抑制曲线极为相似     

昆虫P-450基因特点及研究现状

细胞色素P－450在生物体内的重要作用和功能正日益受到人们的关注,尤其是在药物代谢和致癌机理的研究中引起了人们的广泛兴趣。人们对P－450的研究已深入到基因水平,目前被克隆测序的P－450cDNA已多达300种以上,而且不断有其在体外表达的报道。这主要基于把人、鼠、兔、猴、狗等高等动物作为研究对象[1,2]。虽然,人们很早就认识到P－450在昆虫体内代谢外源性物质和产生抗药性过程中的重要作用,但对昆虫P－450基因的研究起步较晚,目前尚只对少数几种昆虫的P－450研究深入到基因水平。本文简要介绍近年来昆虫P－450基因的研究现状…     

生长抑制因子(GIF)与G蛋白Rab3a直接相互作用

生长抑制因子(growth inhibitory factor, GIF), 又称金属硫蛋白-3, 为68个氨基酸组成的脑特异性金属硫蛋白, 具有广泛的生理功能; GIF可能与阿尔茨海默氏症(Alzheimer's)病理相关, 在Alzheimer's脑提取物存在下, 还对神经细胞具有特异的生长抑制活性.然而, 对其发挥生长抑制作用的分子机制并不清楚.运用酵母双杂交系统从人脑cDNA文库中筛选与GIF相互作用因子,从4.1×10⁶个人脑cDNA文库转化子中,首次筛选到Ras家族G蛋白Rab3a C端,包含87个氨基酸的片段能与GIF相互作用;用PCR自人胎盘总cDNA中获得包含完整Rab3a编码序列的cDNA;通过酵母双杂交实验表明,全长Rab3a蛋白亦能与GIF相互作用.免疫共沉淀和蛋白质印迹实验进一步验证了GIF与Rab3a在哺乳动物细胞中可以相互作用; 而且, Rab3a是以GTP结合形式(GTP-Rab3a)与GIF发生相互作用.     

人细胞核dUTPase的克隆表达及其酶学活性

以阿尔茨海默病 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者脑cDNA文库质粒为模板 ,用PCR方法扩增得到人细胞核dUTP焦磷酸酶 (dUTPase)的cDNA ,将其克隆到谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX 4T 1中 ,并在大肠杆菌BL2 1中获得高效表达 .表达的融合蛋白GST dUTPase经过谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析 ,凝血酶酶切和SephacrylS 10 0纯化 ,得到高纯度dUTPase蛋白 .通过SDS PAGE ,氨基酸组成分析 ,N端氨基酸序列测定以及HPLC测Mr 结果与期望值一致 .通过检测该酶水解dUTP释放的焦磷酸 (PPi)来测定表达产物dUTPase蛋白及GST dUTPase融合蛋白的酶活性 ,发现两蛋白都具有正常的酶水解dUTP活性 ,但融合蛋白的活性比dUTPase蛋白低 7～ 8倍 .同时研究了Mg2 +和EDTA对酶活性的影响     

神经生长抑制因子的功能结构域双体

神经生长抑制因子 (neuronalgrowthinhibitoryfactor,GIF)又名金属硫蛋白 III (metallothionein III,MT III) ,是神经系统中第一个被鉴定的具有神经元生长抑制功能的蛋白质 ,β结构域为其功能结构域。为深入系统地研究GIF及其结构域的结构与功能 ,构建了神经生长抑制因子功能结构域双体 (GIFβ β)。PCR扩增得到N端 β结构域和C端 β结构域的cDNA ,酶切后克隆入原核表达载体pGEX 4T 1,经发酵、诱导表达、亲和层析、凝血酶切和进一步纯化 ,每升菌液约可得重组GIFβ β蛋白 6 0mg。测其电泳行为、氨基酸组成、质谱、金属巯基含量等 ,证明得到了目的蛋白质。圆二色性图谱显示 ,GIFβ β拥有金属硫蛋白家族成员的特征———金属巯基簇结构域。MTT还原法测定神经元抑制活性大小为 :GIF >GIFβ β>GIFβ结构域     

神经生长抑制因子与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病 (Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ′ｓｄｉｓｅａｓｅ ,ＡＤ)是一种以进行性认知障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。其病理特征为神经元内出现大量双股螺旋纤丝 (ｐａｉｒｅｄｈｅｌｉｘｆｉｌａｍｅｎｔ,ＰＨＦ)和细胞外间隙出现 β 淀粉样蛋白 (β ａｍｙｌｏｉｄ ,Ａβ)的沉积 ,即神经元纤维缠结 (ｎｅｏｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｔａｎｇｌｅｓ,ＮＦＴ)和老年斑(ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅ,ＳＰ)的大量存在以及选择性的神经元和突触的丢失[1] 。ＡＤ可分为家族性 (ＦＡＤ)和散发性 (ＳＡＤ)。神经生长抑制因子 (ｎｅｕｒ…     

用低G／C％含量引物通过PCR扩增家蝇细胞色素P—450 cDNA

根据昆虫细胞色素P-450基因的多型性和遗传多态性,以苯巴比妥钠诱导、室内饲养的杀虫剂敏感种群雌性家蝇Musca omestica vicina Macquart为材料,提取总RNA,以0ligo(dT)-纤维素亲和层析分离出总mRNA;以此为模板反转录合成总cDNA。再以总cDNA为模板,以P-450CYP6A1cDNA序列为参考设计一对低G/C%含量引物,进行PCR扩增,获得1.5kb左右的预期目的片段。     

G蛋白Rab3a cDNA的克隆与表达

利用PCR法 ,从人胎盘总cDNA中扩增得到Rab3acDNA的全编码区 .序列分析表明 ,扩增得到的Rab3acDNA有 5个核苷酸发生了变异 ,但翻译的氨基酸与发表的完全一致 .将扩增得到的Rab3acDNA克隆于原核融合表达载体pGEX 4T 1中 ,在E .coliBL2 1中经IPTG诱导表达 .为了进一步鉴定表达产物 ,对纯化后的Rab3a蛋白进行了SDS PAGE、N端氨基酸测序、质谱分子量测定及氨基酸组成分析鉴定 .结果显示 ,表达蛋白的分子量约 2 5kD ,N端氨基酸序列为MASATDSR ,氨基酸组成分析表明 ,Rab3a蛋白获得了正确表达     

早老性痴呆大脑cDNA文库构建及目的基因克隆

 取临床确诊为早老性痴呆 (Alzheimer’sdisease ,AD)患者的大脑组织 ,应用磁珠法直接提取mRNA ,电泳检测其质量 .经逆转录合成双链cDNA后 ,用碱性凝胶电泳检测其大小在 0 .2～ 9.0kb范围 ,主要集中在 1.0～ 2 .0kb之间 .层析除去多余的adaptors ,收集大于 4 0 0bp的cDNA片段 ,与载体pYESTrp2连接 ,经电转化后 ,得到克隆总数为 5.1× 10 5的AD病人大脑cDNA文库 .用PCR技术从该文库中扩增得到小肠三叶因子 (intestinaltrefoilfactor ,ITF) [1] 和神经生长抑制因子 (growthin hibitoryfactor,GIF) [2 ] 的cDNA编码区 .研究表明 ,所构建的cDNA文库质量较高 ,可广泛用于AD病研究工作 .同时 ,将所克隆的GIF编码区插入到载体pHybLex Zeo上 ,构建成带饵基因的质粒 ,为进一步通过酵母双杂交方法搜寻与GIF相互作用的神经因子提供了必要条件     

金属硫蛋白-3对dUTPase调节dUTP细胞毒性作用的影响

金属硫蛋白-3（MT-3）,又称神经生长抑制因子,是一种脑特异性金属硫蛋白。人细胞核dUTP焦磷酸酶（dUTP pyrophosphatase, dUTPase）是最近在脑中研究发现的能与人金属硫蛋白-3（human metallothionein-3,hMT-3）相互作用的一个蛋白,两者共同作用具有神经元生长抑制活性。为了探讨hMT-3对dUTPase调节dUTP引起的细胞毒性作用的影响,通过基因转染HEK293细胞观察细胞在dUTP中的生长情况,发现共转染hMT-3和dUTPase基因的细胞比单转染dUTPase或hMT-3基因的细胞具有更强的对dUTP细胞毒性的耐受能力;同时在大肠杆菌BL21中表达重组蛋白,测定hMT-3在dUTPase水解dUTP中的作用,结果显示重组蛋白hMT-3可以促进dUTPase对dUTP的水解。结果均初步证实了hMT-3对dUTPase抵抗dUTP引起的正常细胞死亡有一定的协同作用,为进一步研究dUTPase及其相互作用蛋白hMT-3在化疗中的应用提供理论依据。