IBV青岛腺胃分离株（SD／97／02）S1蛋白基因的序列测定和分析

参考Genbank上发表的IBV S1纤突蛋白基因序列,设计了一对引物,对鸡传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株（SD／97／02）RNA进行RT－PCR扩增。将PCR产物克隆入pMD18-T载体中进行序列测定和分析。序列分析表明,该毒株的S1基因的G＋C％含量较少,为37.0%,存在HindⅢ,BamHⅠ,BglIⅠ,SacⅠ和SalⅠ位点,无EcoRⅠ位点,与其他毒株的同源性在87.02%－94.21%之间,在第154－429nt处为高度的变异区;将基因序列翻译成氨基酸后,假定的S1蛋白由540个氨基酸组成,等电点8.24,在蛋白质内部存在18个Cys,在S1与S2蛋白之间的剪切位点为HRRRR,这与大多数IBV毒株（RRF／SRR）不一样,有三个区域的氨基酸序列高度保守;169－181aa,230-250aa,485-506aa;与其他毒株进行抗原性比较后发现,在该毒株的320－326aa及390－401aa处的抗原表位消失,而在325－345aa、379－389aa处则出现了很强的抗原表位;第438－444aa处,其他IBV毒株（除ZJ971株外）原来存在的强抗原位点在本毒株中消失。在53－65位的氨基酸抗原性与其他毒株相比明显变弱。     

传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因克隆及在E.coli中的表达

核衣壳蛋白基因 (N基因 )是传染性支气管炎病毒的重要结构基因 .根据已报道的序列设计引物 ,利用RT PCR技术从病毒RNA中扩增和克隆到了N基因的cDNA ,并测定了核苷酸序列 .克隆的N基因片段ORF全长 12 30bp ,编码 4 0 9个氨基酸 .将该片段序列与其他IBV病毒株比较 ,核苷酸的同一性为 87 0 %～ 98 6 %,氨基酸的同一性为 91 0 %～ 98 1%.将该cDNA亚克隆到pBV2 2 0表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,Western印迹检测 ,获得了分子量约 4 5kD表达蛋白     

中国1995～2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增到了我国1995～2004年20株IBV现地分离株的膜蛋白(Membrane,M)基因片段.序列测定表明,20株IBV分离株M基因开放阅读框由672～681bp组成,编码由223～226个氨基酸残基组成的多肽.与我国分离株LX4相比,M基因推导氨基酸序列的变异主要发生在2～17位、221～223位,其中4～6位存在氨基酸的插入和缺失,导致IBV毒株间M蛋白糖基化位点的差异.与GenBank中34株IBV参考毒株M蛋白基因推导氨基酸序列进行比较和分析,系统进化关系显示54株IBV毒株分属于5个进化群.我国IBV分离株M基因在进化关系上较为独立,主要分布在第Ⅱ群和第Ⅳ群,其中第Ⅱ群分离株和中国台湾毒株进化关系密切.此外,参考IBV国内分离株S1基因及N基因系统发育进化树的研究结果,并与M基因进行比较,表明我国IBV也存在着基因重组现象,尤其是疫苗毒和流行毒之间的重组.     

传染性支气管炎病毒江苏分离株核蛋白基因序列测定与同源性分析

将本室鸡传染性支气管炎病毒（IBV）江苏省地方分离肾型毒株JS／95／03接种鸡胚,分离、纯化病毒,提取单股RNA做为反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）的扩增模板。用Genbank公开序列多重比较后设计一对引物,使用单管RT－PCR方法,物异扩增IBV核蛋白（N）基因5'端854bp的片段,扩增产物纯化后测,序列分析表明,IBV N基因也存在较大变异,此毒株与呼吸型疫苗株M41序列同源性最高。     

鸡传染性支气管炎病毒H株纤突蛋白基因的RT-PCR/RFLP分型

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)属于冠状病毒科冠状病毒属,可引起鸡呼吸道、输卵管、肾脏、肠道及腺胃等多部位病变.近年来,由于新的IBV变异毒株不断出现,从而导致鸡传染性支气管炎病的不断爆发,造成严重的经济损失[1].IBV的基因组为单股RNA,约27.6kb,该基因主要编码3种主要结构蛋白:纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N),其中S蛋白成熟裂解为S1和S2两个蛋白亚基.S1蛋白是IBV的主要免疫原基因,可刺激机体产生中和抗体,决定病毒的组织亲嗜性,在病毒血清学分类中起主要作用[1,2].H株是1993年在河南省分离的典型肾病变IBV毒株,我们对IBV的H株S1基因进行了RT-PCR及酶切分析,并将其PCR产物克隆入质粒载体,为进一步研究IBV的H株分子生物学特性和研制IBV基因工程疫苗打下基础.     

中国1995～1999年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株核蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增到了我国1995~1999年10株IBV现地分离株的核蛋白基因片段,并将其进行了克隆、序列测定及分析。结果发现,10株IBV分离株核蛋白基因均含有一个长1 230bp的ORF,编码由409个氨基酸残基组成的多肽,未发现碱基的插入和缺失。与GenBank中的20个IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较和分析,发现本研究分离的毒株主要分布于3个群中,该3群病毒主要包括我国IBV现地分离株。对n基因及其局部功能区序列比较发现,我国分离株与H120疫苗株N蛋白存在广泛的氨基酸变异。通过与s1基因系统发育进化树比较发现,我国IBV分离株存在基因重组现象。以上结果表明我国1995~1999年IBV毒株存在基因突变和基因重组现象。     

传染性法氏囊病病毒野毒株的致病性及其vp2基因比较

对4个IBDV野毒株的致病性和它们的vp2基因高变区序列同时做了比较分析。结果表明,4个IBDV毒株在致病性程度上存在较大差异。其中有一个是真正的超强毒,即GX8／99,其他几个虽然达不到真正超强毒的毒力,但也比经典的标准毒的致死性高得多。在vp2基因高变区,这4个IBDV野毒株与超强毒参考株HK46同源性很高,在DNA水平为96．8％～99．5％,在氨基酸(aa)水平为96．6％～100％o而与疫苗毒D78有很大差异,分别只有91．7％～93．6％和91．8％～93．2％。说明IBDV毒株的vp2基因高变区确实与其致病性有一定关系。特别是SD-1／97、SD-3／98、JS-30／99株之间及其与HK46在DNA和aa水平的同源性高达98．4％和98．6％以上,SD-3／99、JS-30／99株之间及其与HK46的氨基酸同源性为100％。然而,致病性特别高的GX8／99株病毒与其他3个野毒株及HK46在DNA和氨基酸水平的同源性相对较低,在DNA和aa水平的同源性只有96．8％～9712％和96．6％～97．9％。相对于国内的流行毒株和香港超强毒参考株HK46,GX8／99株在致病性和VP2高变区都已发生了一定的变异。     

一株鸭源传染性支气管炎病毒的分离鉴定及结构蛋白基因和血清型分析

【目的】对从广西某鸭场发生呼吸道感染的11天龄樱桃谷肉鸭分离到的病毒株进行鉴定,并探索此鸭源病毒分离株的遗传变异情况。【方法】通过血凝试验、鸡胚接种实验、3?端非编码区(3'UTR)基因扩增与序列测定对分离株进行鉴定,并对该分离株的结构基因S1、E、M和N分别进行序列测定以及相似性、系统进化树分析和血清型鉴定。【结果】血凝试验为阴性,接种鸡胚盲传5代后出现侏儒胚,3?UTR基因测序结果表明为传染性支气管炎病毒(IBV)序列。该分离株S蛋白的裂解位点为RRSRR,S1、E、M和N基因与IBV毒株H120、4/91、LTD3核苷酸相似性分别为:78.6%–99.7%、85.4%–100.0%、91.6%–93.2%、86.7%–91.7%。除N基因存在点突变外,S1、E和M基因均存在氨基酸的突变、插入和(或)缺失。系统进化树分析显示,其S1基因属于4/91型,E、M和N基因均为LDT3型。血清型分析表明,该分离株的血清型不同于疫苗株H120和4/91。【结论】此鸭源病毒分离株为IBV,且该分离株的基因型与血清型均发生了变异。本研究结果暗示禽类传染性支气管炎的防控面临着更严峻的挑战。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株（793／B）核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank已经发表的传染性支气管炎病毒(IBV)N全基因组序列设计引物,对IBV793/B分离毒株N基因进行克隆与序列分析。结果表明,IBV793/B的N基因由1229bp组成,与GenBank已发表的11株IBV的N基因相比较,IBV793/B的N基因共有88处点突变,在第991位发生了一个核苷酸的缺失。N基因的核苷酸同源性为86.9%～91.4%,氨基酸同源性为75.8%～77.5%。表明IBV93/B的N基因存在着较大的变异性。     

肾型IBVS1基因重组BCG菌株的构建及其免疫原性研究

S1基因是传染性支气管炎病毒(IBV)的主要保护性抗原基因,应用RT-PCR技术特异地扩增嗜肾型传染性支气管炎病毒X株的S1基因,经序列分析证实为S1基因,将其连接到含有人结核分枝杆菌启动子hsp70基因和堪萨斯分枝杆菌α信号肽基因的表达载体pRR3上,从而构建了大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pR-α-S1,再电转化至BCG中,形成重组菌株rBCG-S1。热激后S1蛋白在耻垢分枝杆菌M.smegmatismc2155中高效表达,并且通过ELISA和Western blot检测能够被抗IBVS1蛋白的单克隆抗体识别。将106CFU的重组菌株rBCG-S1皮下注射免疫6周龄的SPF鸡,动物保护试验结果表明重组菌株rBCG-S1对鸡具有一定的免疫保护效果,能够保护SPF鸡抵抗IBVX毒株强毒攻击。血凝抑制试验表明血凝抑制抗体滴度能够显著增加。构建的重组菌株为今后开发新型鸡传染性支气管炎基因工程弱毒疫苗奠定了基础。     

Binding of avian coronavirus spike proteins to host factors reflects virus tropism and pathogenicity

The binding of viruses to host cells is the first step in determining tropism and pathogenicity. While avian infectious bronchitis coronavirus (IBV) infection and avian influenza A virus (IAV) infection both depend on α2,3-linked sialic acids, the host tropism of IBV is restricted compared to that of IAV. Here we investigated whether the interaction between the viral attachment proteins and the host could explain these differences by using recombinant spike domains (S1) of IBV strains with different pathogenicities, as well as the hemagglutinin (HA) protein of IAV H5N1. Protein histochemistry showed that S1 of IBV strain M41 and HA of IAV subtype H5N1 displayed sialic acid-dependent binding to chicken respiratory tract tissue. However, while HA bound with high avidity to a broad range of α2,3-linked sialylated glycans, M41 S1 recognized only one particular α2,3-linked disialoside in a glycan array. When comparing the binding of recombinant IBV S1 proteins derived from IBV strains with known differences in tissue tropism and pathogenicity, we observed that while M41 S1 displayed binding to cilia and goblet cells of the chicken respiratory tract, S1 derived from the vaccine strain H120 or the nonvirulent Beaudette strain had reduced or no binding to chicken tissues, respectively, in agreement with the reduced abilities of these viruses to replicate in vivo. While the S1 protein derived from the nephropathogenic IBV strain B1648 also hardly displayed binding to respiratory tract cells, distinct binding to kidney cells was observed, but only after the removal of sialic acid from S1. In conclusion, our data demonstrate that the attachment patterns of the IBV S proteins correlate with the tropisms and pathogenicities of the corresponding viruses.     

鹅新城疫病毒P基因的RNA编辑及其相关蛋白的分子特征

应用RT-PCR方法对鹅新城疫病毒安徽分离株WF00GP基因进行了RNA编辑分析,发现w‰GP基因在保守的编辑位点上插入一个G,使得P基因增加编码V蛋白,而且它的最大ORF的长度为1188bp,编码395个氨基酸的P蛋白。wkG株和参考毒株的P基因的同源性和系统发育分析表明,WF00G株与水禽源毒株NA．1、ZJ1、FPI／02、PX2／03、Duck／1／05和SF02等亲缘关系较近,与传统疫苗株或弱毒株HB92、LaSota和Clone30以及F48E9等的亲缘关系相对较远。进一步对其V蛋白羧基端序列分析发现,虽然编辑位点氨基酸序列（132KKG134）和羧基端的5个Cys残基位点是高度保守的,但是V蛋白c末端氨基酸存在较大变异,APMV-1毒株V蛋白羧基端氨基酸的突变呈现“基因型一致性”。     

北京地区人呼吸道合胞病毒核蛋白基因的序列分析及原核表达

为了解北京地区流行的人呼吸道合胞病毒(HRSV)N蛋白基因的特征,并用大肠杆菌表达获得N蛋白,从2006年1月至3月收集的首都儿科研究所附属儿童医院急性呼吸道感染患儿标本中分离到7株HRSV毒株(3株A亚型,4株B亚型),分别经RT-PCR扩增得到HRSV N蛋白全基因,克隆至pUCm-T载体中并进行测序和分析;从重组质粒pUCm-N9968中经PCR扩增获得N基因,亚克隆入原核表达载体pET30a( )中,得到重组表达质粒pET30a-N9968,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导培养;SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达和抗原性。经扩增并测序,7株HRSV N蛋白基因全长均为1 176 bp,编码一个含391个氨基酸的蛋白;北京地区7株RSV分离株的N蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别在85.4%~99.7%之间和95.4%~100%之间,进一步证明N蛋白基因的高度保守性。经诱导培养产生大量带6个组氨酸标记的重组N蛋白,主要以包涵体形式存在。N蛋白粗提物经Ni2 亲和层析获得较理想纯化。Western blot结果显示,所表达的蛋白能与特异性单克隆抗体和人血清反应。说明本研究构建的重组pET30a-N9968原核表达质粒使N蛋白获得了高效表达,并且具有特异的抗原活性,为今后进一步研究奠定了基础。     

Sequence analysis of the 2009 pandemic influenza A H1N1 virus haemagglutinin gene from 2009-2010 Brazilian clinical samples

In this paper, we analysed the haemagglutinin (HA) gene identified by polymerase chain reaction from 90 influenza A H1N1 virus strains that circulated in Brazil from April 2009-June 2010. A World Health Organization sequencing protocol allowed us to identify amino acid mutations in the HA protein at positions S220T (71%), D239G/N/S (20%), Y247H (4.5%), E252K (3.3%), M274V (2.2%), Q310H (26.7%) and E391K (12%). A fatal outcome was associated with the D239G mutation (p < 0.0001). Brazilian HA genetic diversity, in comparison to a reference strain from California, highlights the role of influenza virus surveillance for study of viral evolution, in addition to monitoring the spread of the virus worldwide.