坚强芽孢杆菌β-淀粉酶基因的核苷酸序列分析

淀粉水解酶广泛用于淀粉加工业中,何秉旺等在选育产耐热β-淀粉酶菌株中得到一株坚强芽孢杆菌（Bacillusfirmus）725,该菌株产生的淀粉酶有较好的热稳定性,水解淀粉的主要产物为麦芽糖。自然菌株产生的淀粉酶往往是多种淀粉酶的混合,为进一步研究该菌株产生的淀粉酶的性质和在工业上应用的可能性,分离了三个淀粉酶基因,在大肠杆菌中克隆和表达[1]。其中重组质粒pBA150产生的淀粉酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖［1］。β-淀粉酶（EC.3．2.1．2）水解淀粉的主要产物是麦芽糖,工业上可用于生产高麦芽糖浆,近年来又有β-淀粉酶用于啤酒工业的报道[2]。本文报道重组质粒pBA150的β-淀粉酶基因的序列分析及推导出的氨基酸序列同己知β-淀粉酶的氨基酸序列比较。     

坚强芽孢杆菌β-淀粉酶基因的核苷酸序列分析

淀粉水解酶广泛用于淀粉加工业中,何秉旺等在选育产耐热β-淀粉酶菌株中得到一株坚强芽孢杆菌（Bacillusfirmus）725,该菌株产生的淀粉酶有较好的热稳定性,水解淀粉的主要产物为麦芽糖。自然菌株产生的淀粉酶往往是多种淀粉酶的混合,为进一步研究该菌株产生的淀粉酶的性质和在工业上应用的可能性,分离了三个淀粉酶基因,在大肠杆菌中克隆和表达[1]。其中重组质粒pBA150产生的淀粉酶的淀粉水解产物主要是麦芽糖［1］。Β-淀粉酶（EC.3．2.1．2）水解淀粉的主要产物是麦芽糖,工业上可用于生产高麦芽糖浆,近年来又有β-淀粉酶用于啤酒工业的报道[2]。本文报道重组质粒pBA150的β-淀粉酶基因的序列分析及推导出的氨基酸序列同己知β-淀粉酶的氨基酸序列比较。     

改良β-极限糊精法测定α-淀粉酶活力

α-淀粉酶随机作用于直链淀粉与支链淀粉的α-14葡萄糖苷键。可水解支链淀粉α-1-6键分枝点内部的α-1-4葡萄糖苷键。形成寡聚糖。又称为内淀粉酶。β-淀粉酶作用于直链淀粉与支链淀粉的α-1-4葡萄糖苷键。从外链末端的非还原端逐次切断。产生麦芽糖。可将直链淀粉完全水解。但对支链淀粉水解至α-16分枝点时即停止作用。又称外淀粉酶。     

甘薯块根细胞中β—淀粉酶主要定位于质体内

淀粉降解代谢与种子萌发、叶片光合作用、块茎和块根贮藏及肉质果实的发育密切相关。体外酶学实验普遍认为,β—淀粉酶是催化淀粉水解的重要酶之一,然而由于其在生活细胞中经常定位于叶绿体或质体之外,与淀粉基质在亚细胞水平上相互隔离,所以该酶在植物活体内的生理功能至今尚不清楚。我们最近首次发现,苹果果实生活细胞中的β-淀粉酶主要定位于质体内,与其淀粉基质居于同一亚细胞区域,但尚不清楚这一现象是否具有普遍性。本研究利用胶体金免疫电镜定位技术证明,甘薯块根生活细胞中的β-淀粉酶也是主要定位于质体内,围绕淀粉粒分布较多,其他亚细胞区域内β-淀粉酶分布很少,说明该酶主要分布于其功能区域。质体内胶体金分布密度随着块根发育的推进显著增加,但β-淀粉酶区隔于质体内的亚细胞分布特点在块根整个生长发育期没有变化。这些结果明确地展示出甘薯块根生活细胞中β-淀粉酶与其淀粉基质居于同一亚细胞区域内,为β-淀粉酶普遍参与植物生活细胞或贮藏器官生活细胞中的淀粉水解提供了证据。     

甘薯块根细胞中β-淀粉酶主要定位于质体内

淀粉降解代谢与种子萌发、叶片光合作用、块茎和块根贮藏及肉质果实的发育密切相关.体外酶学实验普遍认为,β-淀粉酶是催化淀粉水解的重要酶之一,然而由于其在生活细胞中经常定位于叶绿体或质体之外,与淀粉基质在亚细胞水平上相互隔离,所以该酶在植物活体内的生理功能至今尚不清楚.我们最近首次发现,苹果果实生活细胞中的β-淀粉酶主要定位于质体内,与其淀粉基质居于同一亚细胞区域,但尚不清楚这一现象是否具有普遍性.本研究利用胶体金免疫电镜定位技术证明,甘薯块根生活细胞中的β-淀粉酶也是主要定位于质体内,围绕淀粉粒分布较多,其他亚细胞区域内β-淀粉酶分布很少,说明该酶主要分布于其功能区域.质体内胶体金分布密度随着块根发育的推进显著增加,但β-淀粉酶区隔于质体内的亚细胞分布特点在块根整个生长发育期没有变化.这些结果明确地展示出甘薯块根生活细胞中β-淀粉酶与其淀粉基质居于同一亚细胞区域内,为β-淀粉酶普遍参与植物生活细胞或贮藏器官生活细胞中的淀粉水解提供了证据.     

大豆叶片淀粉的降解及淀粉降解酶

在90μmol m~(-2)s~(-1)光强以下可见大豆叶片淀粉的降解,降解速率为0.8～3.8mg淀粉dm~(-2)h~(-1)。淀粉降解通过水解及磷酸解两条途径,α,β—淀粉酶的最适pH5～6,磷酸化酶pH7～8。α—淀粉酶活力随叶片的成长显著增强,β—淀粉酶则有所减弱。叶片淀粉积累或消耗时此三酶活力无显著变化。 黄化小麦叶片照光转绿过程中此三酶活力变化不大。黄化玉米叶片照光转绿过程中磷酸化酶活力降低,β—淀粉酶活力增强。     

发育过程中苹果果实的β-淀粉酶：活性、数量变化和亚细胞定位

淀粉降解代谢与种子萌发、叶片光合作用、块根贮藏及肉质果实的发育密切相关. 体外酶学实验普遍认为, β-淀粉酶是催化淀粉水解的重要酶之一, 然而由于其在生活细胞中经常定位于叶绿体或质体之外, 与淀粉基质在亚细胞水平上相互隔离, 所以该酶在植物活体内的生理功能至今尚不清楚. 用苹果果实进行的实验表明, 在果实发育过程中, β-淀粉酶活性由低到高, 与淀粉含量大致呈现互为消长的变化. Western blotting实验证明, 在果实发育过程中, β-淀粉酶的表观数量也是由少到多, 与活性的变化一致. 利用胶体金免疫电子显微镜定位技术证明, 果实内β-淀粉酶主要定位于质体内, 围绕淀粉粒分布较多, 其他亚细胞区域内β-淀粉酶分布很少, 说明该酶主要分布于其功能区域, 这种亚细胞分布特点在果实整个生长发育期没有变化. 在亚细胞水平上明确地展示出植物生活细胞中β-淀粉酶与其淀粉基质居于同一亚细胞区域内. 质体内胶体金分布密度随着果实发育的推进增加显著, 发育后期的质体内或淀粉粒上存在高密度的胶体金颗粒, 这个结果与Western blotting实验相互印证. 可以认为, β-淀粉酶参与了果实细胞质体中淀粉的水解过程.     

基于谷氨酸棒杆菌NCgl1221蛋白的新型细菌表面展示系统

【目的】开发一种新型的大肠杆菌表面展示系统,为C末端截短NCgl1221蛋白作为锚定蛋白提供科学依据,丰富并优化细菌表面展示系统。【方法】扩增C末端截短NCgl1221序列和β-淀粉酶基因,构建融合蛋白表达载体。将重组载体PET-NA和空载体PET-28a分别转入Rosetta(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白表达情况。将诱导表达菌株进行免疫荧光染色,荧光显微镜观察和流式细胞分析检测β-淀粉酶的展示。酶活测定和淀粉水解分析验证被展示β-淀粉酶的活性。【结果】融合蛋白成功地在大肠杆菌中表达,有活性的β-淀粉酶通过与锚定蛋白C末端的融合被展示在了宿主菌表面,展示β-淀粉酶的重组菌可以水解利用培养基中的淀粉。【结论】成功开发了一种以C末端截短NCgl1221为锚定蛋白的新型大肠杆菌表面展示系统,并以此系统展示了分子量大小为56 kDa的活性酶,为该系统在全细胞催化剂或吸附剂等方面的应用奠定了基础。     

β-淀粉酶对磷酸化酶的“抑制作用”

磷酸化酶和β-淀粉酶是在淀粉合成和分解过程中起主要作用的酶,在植物体中往往同时存在,因此研究这两个酶相互之间的关系是很有意义的。Porter 曾报告不同来源的β-淀粉酶在溶液中对磷酸化酶有抑制作用,她认为此抑制作用的机制主要是β-淀粉酶直接影响磷酸化酶的活动中心。但是我们都知道,β-淀粉酶是分解淀粉的,而磷酸化酶的形成淀粉的作用需要先有淀粉作为引子(primer),当引子量低于一定浓     

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

β—淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达王峥,周蓓芸,郑幼霞（中国科学院上海植物生理研究所,２０００３）关键词高温放线菌,β—淀粉酶,基因克隆β—淀粉酶是一种外切型淀粉水解酶,它从淀粉的非还原性末端依次水解α－１,４葡萄糖昔键,产生分构型的麦芽糖。内...     

由α-淀粉酶催化的淀粉降解的产物究竟是什么?

我国现用的植物生理学教材中有些加入了植物碳水化合物代谢的内客,其中有关α-淀粉酶催化淀粉水解的内容在不同的教材中有不同的表述。潘瑞炽、董愚得合编的《植物生理学》上册(1979年高等学校试用教材)第161页和1983年该书第二版第152页:α-淀粉酶可作用于直链淀粉和支链淀粉,……α-淀粉酶可任意断裂螺旋构型的α-1,4-苷键,割裂出含6—7个葡萄糖单位组成的短链。由于这种酶的作用位置是在淀粉分子之内,故亦称为内淀粉酶(endoamylase)。α-淀粉酶不能水解α-1,6-苷键,故作用于支链淀粉时,就会余下1,6结合的分支部分。α-淀粉酶分解直链淀粉和支链淀粉所产     

复合淀粉酶酶解生淀粉机理探讨

以生土豆淀粉为原料,考察了复合生淀粉酶水解机制。发现单个糖化酶的酶解遵循Michaelis-Menten机制,而α-淀粉酶的酶解不遵循Michaelis-Menten机制;水解过程中复合酶酶解产物d[G]／dt的变化说明α-淀粉酶能很好地协同糖化酶水解生淀粉,其效果不仅仅是两者的简单相加。     

在5L自控发酵罐内热稳定β-淀粉酶的发酵

β-淀粉酶是一种外切型淀粉水解酶,它从淀粉的非还原性末端依此水解α１４葡萄糖苷键,产生β-构型的麦牙糖,在食品、医药工业上有很大用途,但目前工业上使用的β-淀粉酶大多为植物来源。微生物β-淀粉酶的研究自70年代以来陆续有文献报道^[1-6],但至今人才济济 有理想的工业生产菌株推出。我们实验室经过前几年的研究,已得到一株热稳定β-淀粉酶的产生菌株^[7],但以往的发酵研究都在摇瓶内进行,就生产应用而言,必须进行自控小罐的发酵条件试验,以便逐级放大进行中试,最后达到生产规模。本文报道热稳定β-淀粉酶产生菌高温放线菌A61菌株在5L自控发酵罐内的发酵优化研究。     

大曲来源淀粉利用型乳酸菌的筛选及其淀粉利用特性

【背景】乳酸菌是面包、馒头等发酵食品中的重要功能微生物,对改善质地和风味均具有重要作用。淀粉利用能力高的乳酸菌,因其能够在生面粉中更好地定殖而具有重要的应用价值。【目的】筛选获得淀粉水解型乳酸菌并研究其淀粉利用特性。【方法】以浓香型白酒大曲为筛选源,采用淀粉基质碳源对大曲中乳酸菌进行定向富集,结合淀粉发酵能力筛选高淀粉利用能力菌株,并对筛选得到的优良菌株展开淀粉酶表达及其酶活力研究。【结果】以贮存3-6个月的大曲为优秀筛选源,以生面糊传代富集方法可较快筛选出具有良好淀粉利用能力的乳杆菌,主要物种为植物乳杆菌和类食品乳杆菌。对其中一株具有淀粉利用能力的类食品乳杆菌LBM12001的淀粉水解特征和淀粉酶活力展开研究,该菌株淀粉水解能力达10 g/L,并且其在面糊中具有良好的定殖能力;酶活力测定表明,其α-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶为胞外酶;麦芽糖淀粉酶水解淀粉的最适pH值为3.5,比酶活为1 240 U/mg。【结论】建立起从我国传统白酒发酵大曲中高效筛选淀粉水解型乳酸菌的富集筛选方法,以及菌株的水解能力评价方法,获得的胞外麦芽糖淀粉酶分泌型乳杆菌在酸面团、馒头等需进行生面粉发酵食品的生产中具有重要应用前景。     

信息库

1.用细菌α-淀粉酶产生环状α-1,4-葡聚糖从枯草芽孢杆菌X-23中分离到一种新的α-淀粉酶,HGE(氢醌糖基化酶),可以在水溶液中使许多酚类化合物葡糖基化,从HGE和淀粉的反应类型分析,HGE属于细菌糖化α-淀粉酶.作者从HGE对合成直链淀粉的水解产物的HPAEC(高性能阴离子交换柱色谱法)分析结果中发现,有些产物是不被葡糖淀粉酶水解的.这类产物称作“抗萄糖淀粉酶的葡聚糖”.这类葡聚糖可以由HGE水解形成麦芽寡糖,并由HGE和葡糖淀粉酶联合水解形成葡萄糖.为了证明这类葡聚糖是环状α-1,4-葡聚糖,还进行了苯酚-硫酸盐实验,Somogyi-Neison实     

黑曲霉突变株葡萄糖淀粉酶的底物特异性

黑曲霉(Aspergillus niger)突变株T-21葡萄糖淀粉酶(GAI)仅能水解多种淀粉及麦芽低聚糖生成唯一产物β-葡萄糖,其水解麦芽糖及麦芽三糖的速度分别为200和570mg葡萄糖·h^(-1)·mg^(-1).GAI水解α-1,4键的速度比水解α-1.6键快100多倍.除了马铃薯淀粉外,对其它淀粉及麦芽低聚糖几乎都能100%地水解,但不能水解环状糊精,其水解各麦芽低聚糖的最先产物都比原底物少一个葡萄糖单位,说明GAI为一外切型淀粉酶.GAI对麦芽糖、麦芽三糖、可溶性淀粉、糯米淀粉、糊精及糖原的Km值分别1.92mmol/L、0.38mmol/L、0.053%、0.045%、0.059%、及0.076%,V_(max)分别为590、1370、1270、1520、1120和1220mg葡萄糖·h^(-1)·mg^(-1).D-葡萄糖酸-δ-内酯及麦芽糖醇对此酶分别具有反竞争性抑制和混合性抑制.     

原生质体融合技术选育耐热性β-淀粉酶产生菌

从土壤中分离到两株产β-淀粉酶芽孢杆菌菌株,经紫外线、丫-射线,氯化锂、亚硝基胍等诱变和筛选,得到β-淀粉酶高产菌和耐热性β-淀粉酶产生菌各一株。将两菌进行原生质体融合,获得兼有两亲株遗传特性的融合子wg6。从菌落形态和产酶特性等证实此融合子系两亲株融台所得的杂交子代。W96菌株产酶能力介于两亲株之间,酶的热稳定性较高,60℃处理15min,酶活力仍达93．2％。此菌株还可产生少量茁霉多糖酶(一种支链淀粉酶)．与所产生的β-淀粉酶协同作用,使淀粉水解率达到80．6％,因而有较高的应用价值。     

黑曲霉突变株葡萄糖淀粉酶的底物特异性

黑曲霉(Aspergillus niger)突变株T-21葡萄糖淀粉酶(GAI)仅能水解多种淀粉及麦芽低聚糖生成唯一产物β-葡萄糖,其水解麦芽糖及麦芽三糖的速度分别为200和570mg葡萄糖·h~(-1)·mg~(-1).GAI水解α-1,4键的速度比水解α-1.6键快100多倍.除了马铃薯淀粉外,对其它淀粉及麦芽低聚糖几乎都能100%地水解,但不能水解环状糊精,其水解各麦芽低聚糖的最先产物都比原底物少一个葡萄糖单位,说明GAI为一外切型淀粉酶.GAI对麦芽糖、麦芽三糖、可溶性淀粉、糯米淀粉、糊精及糖原的Km值分别1.92mmol/L、0.38mmol/L、0.053%、0.045%、0.059%、及0.076%,V_(max)分别为590、1370、1270、1520、1120和1220mg葡萄糖·h~(-1)·mg~(-1).D-葡萄糖酸-δ-内酯及麦芽糖醇对此酶分别具有反竞争性抑制和混合性抑制.     

微生物GH13家族淀粉脱支酶研究进展

普鲁兰酶和异淀粉酶都具有典型的(β/α)8桶状结构,属于GH13家族淀粉脱支酶.GH13家族的淀粉脱支酶能够专一、高效地水解淀粉分支部位的α-1,6-糖苷键,可以有效提高淀粉原料利用率和生产效率,在淀粉加工工业中具有重要的应用价值,因此近年来对GH13家族淀粉脱支酶的研究逐渐增多.本文系统地综述了微生物来源的GH13家族淀粉脱支酶的国内外研究进展,分别对普鲁兰酶和异淀粉酶的底物特异性及结构基础、研究现状以及应用和研究新趋势进行了阐述.并对GH13家族淀粉脱支酶研究中存在的问题和下一步开发方向提出了见解.     

葡萄糖淀粉酶的结构和功能研究进展

葡萄糖淀粉酶是一种重要的工业酶制剂,属于糖苷水解酶,它将淀粉及类似物水解成β-葡萄糖。近年来,对葡萄糖淀粉酶的研究在酶学性质、结构组成、结构-功能关系等方面取得了长足的进展。本文对这些研究进展进行总结,并针对工业生产中的问题提出相应的解决途径。