人造血干/祖细胞多态性的研究:Ⅷ.人正常骨髓 CD34~ 造血细胞体视学的特征

人CD34~ 造血细胞是具有高度自我更新、多向分化及重建长期造血与免疫学功能的独特体细胞。为系统探索CD34~ 造血细胞的形态、细胞化学及超微结构特征,新近我们设计组合并建立了CIMS-100-FACS 440无菌二次分选术,可使所获CD34~ 造血细胞的纯度达100%。在此基础上,本研究采用Cambri-dge Quantimet 970全自动图像分析仪对光学显微镜、扫描电镜及透射电镜下的CD34~ 造血细胞进行了体视学方面的某些探讨,进一步从三维结构信息中深刻揭示CD34~ 造血细胞的形态计量学特征。经扫描→模数转换←阴影校正→图像暂存←统计分析等检测,结果表明:CD34~ 造血细胞的直径3.490—6.741μm,周长11.776—26.240μm,面积9.565—35.686μm~2,形状因子1.048—1.840,核浆比0.58—0.72,平均光密度0.17675—0.65100,积分光密度2717.217—9870.643。由此可见CD34~ 造血细胞的确为非均一细胞群,这可能与CD34~ 造血细胞的功能亚群与分化阶段密切相关。据我们所知,这是国际上首次有关人CD34~ 造血细胞体视学特征的报道。     

人白血病细胞系KG-1a中肿瘤干细胞样亚群细胞的初步研究

探讨人白血病细胞系KG-1a中是否存在具有肿瘤干细胞样生物学特性的亚群细胞.瑞氏染色和吖啶橙染色分别观察白血病细胞系KG-1a细胞形态和RNA含量:流式细胞术检测细胞周期分布;免疫组化和流式细胞术检测KG-1a细胞CD34的表达;流式细胞术检测CD34 CD38-亚群细胞;烟酸己可碱Hoechst33342染色后用荧光显微镜观察KG-1a细胞中侧群(side population,SP)样细胞所占比例.结果显示,白血病细胞系KG-1a细胞核仁易见,形态原始;部分细胞RNA含量低,细胞处于G0/G1期的比例占15.5%.绝大多数细胞的胞浆和胞膜皆表达CD34抗原,KG-1a中CD34 细胞占96.3%,CD34 CD38-亚群细胞占7.02%;SP样细胞大致比例为7.60%.本研究表明.人白血病细胞系KG-1a中存在具有肿瘤干细胞样生物学特性的亚群细胞.     

CRISPR/Cas9介导的CD34报告基因293AD细胞系的构建

CRISPR/Cas9技术作为一项新起的基因工程技术,在细胞及动物模型基因的编辑修饰中起着越来越重要的角色。CRISPR相关Cas9核酸酶可在特殊设定的单一导向RNA(single guide RNA,sg RNA)的引导下造成基因组DNA双链断裂(DSBs),从而引起同源重组修复(HDR)。利用这种特性,我们构建出了带有CD34-GFP报告基因的293AD细胞系。根据CD34基因组序列,我们设计出了针对CD34基因特异性的单向导向RNA(sg RNA)和带有CD34-GFP报告基因的外源性同源序列。在与Cas9共转染之后,利用嘌呤霉素筛选出基因组DNA中插入有CD34-GFP报告基因的293AD细胞。之后我们对筛选出的293AD细胞进行单细胞分选,并利用PCR扩增对CD34绿色荧光报告基因的插入进行了验证。最后,我们将PCR扩增结果阳性的单克隆293AD细胞系的基因组进行DNA测序。DNA测序结果显示,分选出来的细胞基因组里确实包含有CD34-GFP报告基因。最终,我们成功利用CRISPR/Cas9系统构建出了绿色荧光标记的CD34报告基因293AD细胞系,为后续人体细胞诱导去分化成造血干细胞提供了有利的工具。     

用双参数流式细胞光度术(FCM)研究阿克拉霉素对L_(1210)白血病细胞周期的影响

本文用双参数FCM技术,对同一个细胞的DNA和RNA含量进行相关测量,比较了ACM B对小鼠L_(1210)白血病细胞周期和RNA含量的影响.结果发现在一次给药后8小时可导致早、中期S的积累,并抑制S期细胞的DNA合成;到24小时DNA合成恢复正常,并进入G_2期,但由于G_2期细胞进入M期受阻,造成G_2期细胞的积累,这时被阻断在G_2期的细胞RNA含量显著增加,形成正不平衡生长,而给药剂量较大的实验组(1/1.5LD_(50))S期细胞的RNA含量不随着DNA含量的增加而增加,形成负不平衡生长,ACM A和ACM B对体内Li_(210)细胞周期作用相同.     

5-FU富集人白血病细胞系KG-1a中肿瘤干细胞样亚群细胞

探讨利用细胞周期特异性药物5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)从人白血病细胞系KG-1a中富集肿瘤干细胞样亚群细胞.体外药物敏感试验确定5-Fu的最佳作用浓度和作用时间;KG-1a细胞经5-FU药物处理后,流式细胞术检测存活细胞群中CD34+CD38-亚群细胞比例;吖啶橙染色观察细胞内的核酸组成;RT-PCR半定量检测细胞内三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2(ATP-binding cassette superfamily G member 2,ABCG2)mRNA的表达;半固体培养观察细胞的集落形成能力.结果显示,50 μg/ml 5-FU作用KG-1a细胞4天后,CD34+CD38-亚群细胞比例提高10倍以上;吖啶橙染色可见大部分细胞核酸以发出绿色荧光的DNA为主,RNA含量低;此类细胞高表达ABCG2 mRNA水平;而药物处理后细胞集落形成数量较未处理细胞明显减少.研究结果表明,利用5-FU能够杀死增殖期细胞的性质,成功建立体外药物筛选富集人白血病细胞系KG-1a中肿瘤干细胞样亚群细胞的方法.     

人造血干/祖细胞多态性的研究:Ⅲ.骨髓CD34~ 造血干/祖细胞功能亚群的分析

CD 34~ 造血干/祖细胞(HSC/HPC)是十分异质性的,由多个不同功能亚群所构成,在分化方向与重建造血等方面差异显著。本文对正常人骨髓CD 34~ HSC/HPC各亚群进行了较全面的分析。首先以阳性选择策略,采用Isolex~(TM) 50免疫磁球分选术富集骨髓CD 34~ HSC/HPC,其纯度>90%,随之采用免疫荧光抗体双标记二维流式细胞仪对其测定,发现高纯度的CD 34~ HSC/HPC可分为八个不同亚群:1.CD 34~ /CD 71~-(23.4%—56.6%)与CD 34~ /CD 71~ (33.4%—66.6%);2.CD34~ /CD 45~-(80.8%—82.5%)与CD34~ /CD 45~ (8.1%—11.2%);3.CD 34~ /CD 33~-(20.4%—80.6%)与CD 34~ /CD 33~ (14.6%—64.8%);4.CD 34~ /DR~-(6.3%—11.0%)与CD 34~ /DR~ (82.8%—85.5%)。用免疫胶体金——免疫桥酶联组化双染色对上述亚群进一步分析的结果与流式细胞仪的高度一致,为研究各亚群的功能与生物学特性提供了坚实基础     

转基因骨髓基质细胞系对人脐血CD34+细胞的体外扩增作用

为探讨转染FL和/或TPO基因骨髓基质细胞系对脐血CD34+细胞的体外扩增效应, 建立了转基因骨髓基质细胞系共培养体系. 采用免疫磁珠法分离人脐血CD34+细胞, 在CD34+细胞不同体外培养体系中取样测试细胞总数、CD34+细胞百分率和CFC(包括CFU-GM 和BFU-E). 结果表明, 在8种不同组合的培养体系中, 转基因基质细胞共培养体系较无基质液体培养体系对细胞总数, CFC, CD34+细胞均具有明显的扩增效应, 其中以SCF + IL-3 + HFT扩增效果最好, 分别扩增了(893.3±52.1), (74.5±5.2)和15.7倍. CFU-GM和BFU-E在第2周时达扩增高峰, 扩增倍数分别为(78.1±5.5)和(57.0±19.7). LTC-IC测定结果显示, 只有SCF + IL-3 + FL + TPO和SCF + IL-3 + HFT组有LTC-IC的存在, 统计学检验无显著性差异. 上述结果提示, 转基因骨髓基质细胞系可通过细胞间的接触协同其他细胞因子增强对脐血CD34+细胞的体外扩增作用.     

人体骨髓长期培养中粘壁层的基质细胞

应用免疫荧光技术对人体骨髓长期培养(HLTBMC)粘壁层细胞作了研究,发现在不同的基质细胞中有着下列表面标记:基质成纤维细胞CD 10~+,FIB 86.3~+,CD 13~+,CD 71~+;脂肪细胞CD 10~+,FIB 86.3~+,CD 13~+,CD71~+/-,CD 14~+,CD 33~+,CD 25~+,HLA-DR~+,CD 19~+,CD 5~+,基质成纤维细胞的标记与两次传代的骨髓成纤维细胞以及皮肤和脾脏的成纤维细胞相似。HLTBMC中的成纤维细胞较之非巨噬细胞的小圆形造血细胞,数量上占很大的优势,加之镀银染色发现网状纤维增多,提示HLTBMC后期造血活性的消失可能与临床上的骨髓纤维化有着相似的机理。     

两种不同密度分离液分离的脐血CD34+、CD34-细胞造血活性比较

目的:比较两种不同密度的ficoll-泛影葡胺分离造血干细胞群的效果,找出更适合分离脐血造血干、祖细胞的分离密度,为脐血造血干细胞的医学研究及临床应用提供一定依据。方法:采集脐血6份,根据密度梯度离心法,用质量分数为(1.068±0.001)g/m L、(1.077±0.001)g/m L ficoll-泛影葡胺分离液等量分离同一份脐血,分别计数这两种分离液的单个核细胞获得率及细胞存活率,得到的单个核细胞再分别经免疫磁珠分选法获得高纯度的CD34~+细胞及除去了CD34~+的单个核细胞(CD34~(-depleted) MNCs),统计分析这两种不同密度分离液获得的CD34~+细胞、CD34~(-depleted)MNCs在甲基纤维素中形成CFU-GM集落数。结果:1(1.068±0.001)g/m L、(1.077±0.001)g/m L两种分离液分离的单个核细胞平均密度分别为(1.52±1.0)×10~6个/m L、(2.84±0.98)×10~6个/m L,(P0.05);经免疫磁珠纯化后的CD34~+细胞占单个核细胞(MNCs)的比率分别是(1.26±0.47)%、(1.07±0.15)%,(P0.05);2(1.068±0.001)g/m L分离的单个核细胞经免疫磁珠纯化后1.5×10~3个CD34~+细胞形成CFU-GM的集落(140.5±14.5)显著多于(1.077±0.001)g/m L的集落数(118.3±13.8)(P0.05);(1.068±0.001)g/m L分离的5×10~4个CD34~(-depleted) MNCs形成的CFU-GM集落数(132.0±5.1)也显著多于(1.077±0.001)g/m L的集落数(101.3±9.4),(P0.05)。结论:与1.077 g/m L Ficoll相比,1.068g/m L Ficoll-泛影葡胺分离液分离的单个核细胞中的CD34~+、CD34~-细胞造血活性更强,更适合用来分离脐血中造血干细胞群。     

人骨髓CD34^＋造血细胞体外扩增形成HPP—CFC造血祖细胞的能力

目的和方法：高增殖潜能集落形成细胞（ＨＰＰＣＦＣ）是表达ＣＤ３４＋ＤＲＬｉｎ－的最早期造血祖细胞之一,它在体外的增殖分化能力可反映造血干细胞的某些特征。结果：本文研究了人正常骨髓ＣＤ３４＋造血细胞在体外扩增和形成ＨＰＰＣＦＣ的能力。利用ＣＩＭＳ１００免疫磁性分离术首先获得＞９０％的ＣＤ３４＋造血细胞以富集ＨＰＰＣＦＣ。在含有Ｅｐｏ＋ＧＭＣＳＦ＋ＩＬ３＋ＩＬ６＋ＳＣＦ（简ＥＧＩＩＳ）的无基质液培条件下,ＣＤ３４＋造血细胞在四周内可持续产生单个核细胞和ＨＰＰＣＦＣ,并使其总量最高可达１７７０倍和８倍,以第２和３周为最佳时期,但不同个体ＣＤ３４＋造血细胞的这种能力差别较大。结论：高度纯化的人骨髓ＣＤ３４＋造血细胞能够在含有最佳组合造血生长因子的无基质液培条件下持续扩增,为临床应用提供了重要依据。     

重组人卵泡刺激素在昆虫细胞中的表达

为了研究在昆虫细胞中表达重组人卵泡刺激素,我们以人胎盘组织提取的染色体DNA为模板,利用重叠PCR方法扩增出hFSHβ亚基的cDNA的编码区。将此cDNA克隆入核型多角体病毒(AcNPV)非融合蛋白基因表达载体pVL1393,我们得到了表达载体pVL1393-hFSHβ,然后与BaculoGold~(TM)线性杆状病毒DNA共转染昆虫细胞SF9,经多次扩增后获得高滴度的重组病毒AcNPV-hFSHβ。将此重组病毒感染昆虫细胞,我们得到了在胞浆中表达的hFSHβ亚基,Western blot显示分子量大约为21kDa。以重组病毒AcNPV-hFSHβ与AcNPV-hCGα一同感染昆虫细胞得到了具有分泌性的重组hFSH异二聚体,在非还原的条件下Western blot显示分子量大约为33kDa。     

用体外免疫的人淋巴细胞建立抗破伤风类毒素的杂交瘤克隆

我们应用破伤风类毒素体外免疫的人扁桃体细胞和人-鼠异源骨髓瘤RF 系细胞进行融合,从中筛选到一株杂交瘤细胞89112—50,并通过克隆化筛选获得了两个亚克隆,其分泌的抗体是抗原特异的,和三种抗原(OVA、TC-S、FYG)都不交叉,分泌抗体的功能也比较稳定,在培养瓶内连续扩增传代13次后,仍维持相当高的抗体分泌能力,在常规传代培养过程中所收集的培养物上清液中抗体的含量平均为69.6μg/ml。     

人上皮细胞角蛋白纤维结构转化的分析

用0℃冷冻处理2—3 h,一些PcaSE-1和BEL-7404细胞的角蛋白纤维能部分地转化成凝聚颗粒,但在HeLa 和CNE 细胞中不发生这种角蛋白纤维结构转化。当回复温度到37℃15—30 min 时,PcaSE-1 和BEL-7404细胞的这种结构转化能快速回复。相反,在HeLa 和CNE 细胞有丝分裂时,角蛋白纤维能转化成凝聚颗粒,但PcaSE-1细胞和BEL-7404细胞的角蛋白纤维网始终维持纤维状态,且围绕纺锤体分布。上述结果表明:两类上皮细胞角蛋白纤维结构的转化似由不同因子所引起。我们的结果还指出:(1)单用秋水仙素或用秋水仙素和细胞松弛素D 合并处理PcaSE-1细胞不能引起角蛋白纤维凝聚。但经秋水仙素解聚微管后,会增强细胞对冷处理的凝聚反应。(2)冷处理时角蛋白纤维凝聚的形成与细胞是否具有两套不同的中间纤维无关。(3)予先用TritonX-100抽提细胞,角蛋白纤维在冷冻后不能转化成凝聚颗粒。(4)冷冻处理引起的结构转化可能是某些上皮细胞系的角蛋白纤维的一种特殊性质。     

人胰腺内分泌细胞中CD 57免疫反应性的表达

CD57是一种分子量为110 KD的糖蛋白,它是人类自然杀伤细胞(NK)和杀伤细胞(K)的特异性表面抗原。用它免疫小鼠产生的抗CD57单克隆抗体可特异性识别人的NK 和K 细胞表面抗原。本文应用ABC 免疫组织化学染色结合葡萄糖氧化酶DAB-硫酸镍铵显色技术研究了CD 57在人胰腺的表达和分布。结果发现,CD 57免疫反应(CD 57一IR)细胞主要分布在胰腺的内分泌部(胰岛),偶见于胰腺外分泌部的腺泡和导管上皮中。多数CD 57-IR 细胞呈典型内分泌细胞的形态特征。相邻切片法证明大多数Glu,SS,HPP 和PS 免疫反应细胞呈CD 57阳性。胰腺内神经纤维亦呈CD 57阳性。少数呈CD 57阳性的NK 和K 细胞散布在胰腺结缔组织中。本文对CD 57免疫反应性在人胰腺内分泌细胞中表达的意义进行了讨论。     

中等纤维在几种人体上皮细胞有丝分裂过程中的行为

本文用间接免疫荧光法和电镜术观察了分别来自人表皮(PcaSE-1)、复层上皮(CNE)和单层上皮(SPC-A-1)的3个上皮细胞系的细胞在有丝分裂过程中中等纤维的行为。结果表明,CNE细胞和SPC-A-1细胞表达两种不同类型的中等纤维系统:角蛋白纤维和波形纤维,而PcaSE-1细胞仅表达角蛋白纤维。当细胞进入有丝分裂时,PcaSE-1细胞的角蛋白纤维维持完整的形态且将有丝分裂纺锤体围绕在细胞中央。相反,在CNE细胞和SPC-A-1细胞中,在细胞有丝分裂时,角蛋白纤维解聚成无定形的胞质小体,然而它们的波形纤维始终保持完整的形态。我们认为(1)在分裂上皮细胞中,角蛋白纤维的解聚与细胞的恶性程度有关,而与间期上皮细胞中是否含有丰富的角蛋白纤维无明显关系。(2)在上皮细胞有丝分裂时,中等纤维可能参于纺锤体的定位和趋中。(3)在分裂CNE细胞中,波形纤维的可能功能是染色体的定位和定向。     

甲胎蛋白在体外对人肝癌细胞生长的影响

本文用MTT比色法观察了甲胎蛋白(AFP)在体外对人肝癌细胞生长的影响。结果表明,AFP能促进SMMC-7721人肝癌细胞的生长。当AFP与AFP抗体合用时,AFP抗体能减弱AFP对SMMC-7721细胞生长的促进作用;AFP抗体单用对此种细胞的生长亦有抑制作用。另一方面,在相同的实验条件下,AFP和AFP抗体对HL-60人白血病细胞的生长无明显影响;提示AFP的促生长作用具有一定的肿瘤细胞特异性,并非一种蛋白质对培养细胞的非特异性营养作用。此外,AFP亦能促进MCF-7人乳腺癌细胞的生长,AFP抗体对此种细胞的生长有抑制作用。由于MCF-7细胞存在功能性AFP受体,也能合成和分泌AFP。这就提示,人肝癌细胞中的AFP很可能与其受体特异性结合,产生促生长效应。确切机制尚待进一步阐明。     

体外诱发抗体生成过程中淋巴细胞的变化

为了了解体外抗体应答中T、B淋巴细胞的变化,以进一步阐明体外抗体应答的细胞学过程,并为完善体外免疫实验系统提供方向和依据,利用荧光激活细胞分选仪(FACS),在本实验室建立的人淋巴细胞体外免疫实验系统的基础上,对体外诱发抗体应答中淋巴细胞的变化进行了分析和研究,得到以下初步结果。一、T细胞所占比例的变化与设置培养物时细胞浓度相关,如果T细胞一开始占比例较大时,其变化为下降,否则其变化为上升。但最终都维持在30%上下。二、CD4~+(T辅助)细胞和CD8~+(T抑制)细胞的变化在扁桃体细胞和脾细胞中有所不同。在两周的培养过程中,前者无论加或不加C.M.(T细胞条件培液)或MTG(混合丝裂原),CD4~+细胞的比例均高于CD8~+细胞;而后者在加了C.M.或MTG后,CD8~+细胞的比例明显上升,但CD4~+细胞却有下降趋势。论文讨论了上述变化与免疫应答强度的可能关系。此外,亮氨酸甲酯(Leu-O-Me)的加入对CD8~+细胞没有影响。三、B淋巴细胞的变化,在培养两周过程中,无论扁桃体还是脾脏来源的细胞,B细胞富集的程度没有发生明显的变化,直至培养结束时,B细胞的比例仍维持在60%左右。T、B细胞间的比例也无明显变化,这表明所建立的体外免疫实验系统对B细胞的存活及其应答的诱发是适宜的。CD19~+B细胞的变化较为明显,其意义目前尚难推测。此外,一般认为CD5~+B细胞是一类分泌自身抗体的细胞,在培养过程中一直处于少数,未见增多。四、对于本实验中设置“框界”(“gating”)的合理性进行了讨论。     

丁酸钠对人胃癌和食道癌细胞的生物学效应

5mM丁酸钠可使人胃癌MGc803细胞形态发生改变,细胞变长,出现胞浆突起,趋向于成纤维细胞形态的变化,使食道癌ECa109细胞的核/质比下降。同时能抑制细胞增殖,使细胞生长率下降,丁酸钠对细胞增殖的抑制作用是随其浓度的增加而增强的,具有剂量依赖关系。丁酸钠可促进人胃癌MGc803细胞胞质中微管和食道癌ECa109细胞内中等纤维的组装,这种变化对丁酸钠处理后细胞形态的改变有关。丁酸钠可使细胞阻断于G_1期。??对3’,5’-cAMP—PDE(cAMP-磷酸二酯酶)活力具有强的抑制作用,并提高细胞内cAMP水平,从而抑制细胞增殖。这些结果表明丁酸钠对人胃癌MGc803和食道癌ECa109细胞具有一定的诱导分化作用。